Study of the cytotoxic activity and immunogenicity of the differentiated morphotypes of the genus Mycobacterium, in relation with their cell wall composition

Abstract

Mycobacterium és un gènere de microorganismes que compren importants patògens de la humanitat, com l’agent etiològic de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis. Moltes espècies de micobacteris presenten dos morfotips diferenciats, el rugós (R, de l’anglès “rough”) caracteritzat per la capacitat dels bacteris d’organitzar-se formant estructures que recorden cordes; i el llis (S, de l’anglès “smooth”) sense organització dels bacils. En micobacteris patògens s’ha descrit que els morfotips R produeixen malalties més severes en pacients infectats que els morfotips S. De fet, la relació entre virulència i formació de cordes es coneix des de 1947. De manera que estudiar com els bacteris s’agreguen ajudarà a entendre aquesta diferència entre la virulència associada als dos morfotips de micobacteris. La tesi presentada a continuació consisteix en un estudi de la citotoxicitat i la immunogenicitat d’aquests dos morfotips diferenciats, el R amb fenotip formador de cordes i el S amb fenotip no formador de cordes, en Mycobacterium abscessus i Mycobacterium vaccae. I, en el cas de M. abscessus, com aquests efectes en la virulència i la formació de cordes pot estar relacionat amb la composició de la seva paret cel·lular. Els dos morfotips de M. abscessus van ser usats per a infectar cèl·lules epitelials alveolars humanes, i els morfotips de M. vaccae per infectar macròfags murins. En els dos casos els resultats van mostrat un major efecte supressor del creixement cel·lular i una capacitat superior d’activar la producció de citocines per part dels morfotips R. Com s’ha comentat, la virulència dels mycobacteris i la seva capacitat per formar cordes pot estar relacionada amb l’expressió de determinats components cel·lulars exteriors. Per aquest motiu es van fer extraccions superficials lipídiques en M. abscessus. En aquests extractes superficials es van poder identificar els polifleats de trehalosa (TPP, de l’anglès “trehalose polyphleates”), però només en els extractes dels morfotips R. Els TPP no estaven presents en els extractes de morfotips S. Aquest compost no va presentar citotoxicitat en front a cèl·lules humanes i murines. Tot i així, es va detectar potencial agregatiu. Analitzant l’expressió superficial de TPP en altres espècies de micobacteris es va detectar un altre compost superficial en Mycobacterium smegmatis, amb un patró de migració molt semblant al de TPP. En aquesta tesi, aquest compost va ser correctament caracteritzat com a pentatriacontatrienil micolat, ja que en treballs previs s’havien detectat incerteses en referencia a la seva estructura. En conclusió, els morfotips R de M. abscessus i M. vaccae produeixen major efecte citotòxic i immunogènic que els morfotips S en models cel·lulars in vitro. En el cas de M. abscessus, aquesta major virulència està acompanyada d’una expressió superficial de TPP, un compost amb propietats agregatives. Aquest últim resultat senyala TPP com una molècula candidata a ser responsable de la formació de cordes en els morfotips R de M. abscessus.

Mycobacterium is a genus of microorganisms that comprise important human pathogens, such as the etiological agent of tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis. Many mycobacterial species present two differentiated morphotypes, the rough (R) one characterized by bacillar organization in structures that reassemble cords; and the smooth (S) one without any bacillar aggregation. In pathogenic mycobacteria, R morphotypes are shown to produce more severe illnesses in infected patients than S morphotypes. In fact, this relationship between virulence and cord formation is known since 1947. Studying how bacteria aggregate will help to understand the different virulence associated to the two morphotypes of mycobacteria. The thesis here presented consists on the study of the cytotoxicity and immunogenicity of these two differentiated morphotypes, the R with a cording phenotype and the S with a non-cording phenotype, in Mycobacterium abscessus and Mycobacterium vaccae. And, in the case of M. abscessus, how these effects in virulence and the cord formation can be related to its cell wall composition. The two morphotypes of M. abscessus were used to infect human alveolar epithelial cells, and the ones from M. vaccae, in murine macrophages. The results, in both cases, showed that R morphotypes have major effect in suppressing cellular growth and a higher capacity to trigger cytokine production than S morphotypes. Superficial lipidic extractions were performed in M. abscessus, as the virulence and the cord formation might be related with the expression of determinate external cell wall components. Trehalose polyphleates (TPP) were identified in the superficial extracts from R morphotypes of M. abscessus, but TPP were absent in S morphotype extracts. Although this compound was not cytotoxic for human and murine cells, TPP presented aggregative potential. When analyzing the superficial expression of TPP in other mycobacterial species, another superficial compound, mycolate ester wax, was detected in Mycobacterium smegmatis, with a similar migration pattern to TPP. In this work, this compound was clearly characterized as pentatriacontatrienyl mycolate, as some uncertainties regarding its structure were previously reported. In conclusion, R morphotypes from M. abscessus and M. vaccae produced a major cytotoxic effect and major immunogenicity that S morphotypes in cell-based in vitro models. In the case of M. abscessus, this major virulence was accompanied with the superficial expression of TPP, a compound with aggregative properties. These last results point TPP as candidate molecules responsible for the cord formation in R morphotypes of M. abscessus.