Análisis transcriptómico para identificar genes biomarcadores del estado nutricional en la dorada (Sparus aurata): efecto de la sobreexpresión hepática de SREBP-1a

Abstract

La acuicultura es una importante actividad económica vinculada a la producción de alimentos que se encuentra en etapa de expansión. Sin embargo, la producción de especies carnívoras como la dorada (Sparus aurata) presenta limitaciones, tales como la necesidad de incluir en los piensos altas concentraciones de proteína (incorporada en la forma de harina de pescado). Es por ello que debido a la importancia comercial que representa la dorada en la Unión Europea y particularmente en España, se han hecho grandes esfuerzos en investigación con el fin de entender los mecanismos moleculares encargados de regular el metabolismo intermediario de estos peces. En este sentido, son relevantes y cada vez más abundantes los estudios concernientes a los mecanismos de regulación génica como consecuencia del estado nutricional en peces. Gracias a las tecnologías de secuenciación de nueva generación (que permiten obtener resultados en un período corto de tiempo y a un costo significativamente inferior a los métodos tradicionales), en la última década son diversos los proyectos que han permitido el incremento de la información transcriptómica de dorada. A pesar de ello, ninguno de estos estudios se ha llevado a cabo sobre muestras de hígado, así como tampoco se han estudiado las variaciones consecuencia del estado nutricional y la composición de la dieta. El objetivo principal de esta tesis doctoral fue desarrollar un transcriptoma con muestras de hígado y músculo esquelético de cinco grupos de doradas alimentadas durante un período de 23 días, con piensos de distinta composición de macronutrientes (carbohidratos, proteínas o lípidos), así como de un sexto grupo de peces sometidos a ayuno por ese mismo período de tiempo. Este enfoque metodológico permitió caracterizar el transcriptoma de ambos tejidos, así como la obtención de una base de datos transcriptómicos de amplia cobertura y de interés para el desarrollo de estudios nutricionales. Se ensamblaron 21.093 secuencias únicas a partir de 660.166 y 547.544 lecturas de alta calidad de muestras de hígado y músculo esquelético respectivamente, en un transcriptoma que denominamos híbrido. Estas secuencias fueron utilizadas para el diseño de microarrays de oligonucleótidos que nos permitieron analizar cambios en el patrón de expresión génica como consecuencia del ayuno y la composición de la dieta, con el fin de identificar rutas metabólicas y genes biomarcadores relevantes del estado nutricional y la asimilación de nutrientes por parte de la dorada. Este análisis permitió establecer la importancia de la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa, así como del metabolismo lípidico, como consecuencia del estado nutricional y la composición de la dieta en estos peces. Mediante RT-qPCR se validaron los resultados obtenidos y se identificaron algunos genes biomarcadores, tales como algunos miembros del complejo IV de la cadena respiratoria, que incrementan su expresión en peces sometidos a un ayuno prolongado; o genes relacionados con la síntesis de ácidos grasos y colesterol que varían su expresión en relación con la composición de la dieta. Debido a la importancia que presenta el metabolismo de los lípidos en dorada y a la relación existente del factor de transcripción SREBP-1a tanto con el metabolismo de lípidos como con el metabolismo de carbohidratos, se estudió el efecto metabólico de la sobreexpresión de SREBP-1a en el hígado de doradas alimentadas con dietas de diferente composición. Para ello se administraron nanopartículas de quitosán-tripolifosfato acomplejadas con un plásmido de

expresión del fragmento nuclear de SREBP-1a de hámster. El incremento de la expresión hepática de SREBP-1a promovió el aprovechamiento de los carbohidratos de la dieta mediante un incremento en la expresión de genes glucolíticos, así como la de genes relacionados con la síntesis de lípidos. Estos datos sugieren un incremento en la producción de lípidos aparejado a un mayor aprovechamiento de carbohidratos, lo que a su vez permitiría una disminución en la utilización de proteínas de la dieta en la acuicultura.

Aquaculture is an economic activity linked to food production, which is currently an expanding activity. However, the production of carnivorous species such as Gilthead Sea Bream (Sparus aurata) is limited by inclusion of high levels of dietary proteins (fish meal) in feedstuffs. Due to the economic impact of S. aurata farming in the European Union and, in particular, in Spain, remarkable efforts are nowadays devoted to understand the molecular mechanisms that govern the intermediary metabolism of S. aurata. In this regard, studies addressing genetic regulation by the nutritional status in fish are of increasing relevance. The new generation sequencing technologies allow to obtain transcriptomic data in a shorter period of time and at a lower cost than traditional methods. Therefore, during the last decade a number of scientific projects increased transcriptomic data available for S. aurata. In spite of these studies, there are no data concerning the pattern of gene expression in the liver due to changes in the nutritional status and diet composition.

The main goal of the present doctoral thesis was to obtain a transcriptome from liver and skeletal muscle samples from five groups of fish fed during 23 days with diets differing in macronutrient composition (carbohydrates, proteins or lipids) and a sixth group of fish subjected to fasting for that same period of time. This approach allowed us to obtain the liver and skeletal muscle transcriptomes of S. aurata and a deep-coverage database of nutritional interest. A total of 21,093 unique sequences were assembled from 660,166 and 547,544 high quality reads of liver and skeletal muscle samples, respectively, to obtain the herein named hybrid transcriptome. Unique sequences were used to design an oligonucleotide microarray that was subsequently used to analyze the pattern of gene expression in fish submitted to starvation and changes in diet composition in order to identify metabolic pathways and biomarker genes relevant for the nutritional status and nutrient utilization in S. aurata. We concluded that nutritional status and diet composition highly affect the respiratory chain, oxidative phosphorylation and lipid metabolism in S. aurata. Microarray data were validated by RT-qPCR, leading to the proposal of several key biomarkers genes, such as some members of complex IV of the respiratory chain, whose gene expression increases in fish subjected to prolonged fasting, and dependence on dietary macronutrient composition of the expression of genes involved in fatty acid and cholesterol biosynthesis. Given the relevance of lipid metabolism in S. aurata and the role exerted by the transcription factor SREBP-1a in the control of both lipid and carbohydrate metabolism, the metabolic effect of SREBP-1a overexpression was studied in the liver of S. aurata fed with different diets. To this end, chitosan-tripolyphosphate nanoparticles complexed with a plasmid expressing the nuclear fragment of hamster SREBP-1a were administered to S. aurata. Overexpression of SREBP-1a stimulated the expression of genes involved in glycolysis and lipid synthesis, suggesting the use of dietary carbohydrates coupled to lipid production, a mechanism that would enable a protein sparing effect in fish farming.