Functional, genomic and molecular characterisation of Mtl1, an element of the CWI pathway of Saccharomyces cerevisiae with a role in the oxidative stress response

Abstract

Saccharomyces cerevisiae és un microorganisme eucariota que s’utilitza com a model per l’estudi de les vies de transducció de senyal implicades en la resposta a estrès oxidatiu. Fins l’actualitat, no s’ha descrit l’existència d’una via específica de senyals d’oxidació. Mtl1 es un membre de la via CWI (Cell Wall Integrity: via d’integritat cel.lular) que funciona com un sensor transmembrana que dectecta l’estrès oxidatiu. En aquest estudi es demostra que Mtl1 es esencial en el procés de senyalització de l’estrès oxidatiu i quiescència cap a la via CWI i cap al factor general de resposta a estrès Msn2/Msn4. En aquest últim cas, la senyalització es duu a terme a través de Rom2 i Rho1 (i probablement de Pkc1) cap a l’inhibició de les funcions Tor1 i Ras2. La funció de Mtl1 es necessaria per: i) la repressió de la transcripció de gens ribosomals, ii) l’inducció transcripcional Msn2/Msn4 i iii) l’activació la via CWI en resposta a estrès oxidatiu i dejú de glucosa. En la segona part d’aquesta tesi, es demostra que el domini citoplasmàtic de Mtl1 interacciona físicament amb Rom2, la GEF (GTP Exchange Factor: factor intercanviador de GTP). Les nostres dades suggereixen que l’activitat de Slt2 es important per la supervivència en condicions de quiescència. No obstant, Msn2/Msn4 contribueixen de manera significativa a la supervivència cel.lular davant condicions oxidatives. A més a més, l’absència de TOR1 o RAS2 es suficient com per induir l’activació de Slt2 de manera independent de Mtl1, en les condiciones d’estrès anomenades prèviament. Tot això suggereix que entre CWI, TOR i RAS-cAMP s’estableixen un seguit de reaccions creuades encaminades a asegurar que les cèl.lules siguin capaces d’adaptar el seu creixement i la seva maquinaria metabòlica adecuadament. Mtl1 es N-glicosila i es O-manosila, principalment per la manosil transferasa Pmt2. Mtl1 es localitza preferentment i de manera homogènia en la perifèria cel.lular, gemma, septe i extrem apical del shmoo. La manosilació de Mtl1 es important per la localització de Mtl1 de manera regular en la perifèria i en l’extrem apical del shmoo. La O-manosilació catalizada per Pmt2 en general, i en particular la O-manosilació de Mtl1, poseeixen una gran relevancia en: a) la resposta a estrès oxidatiu; b) davant el bloqueix de la via TOR; i c) en l’extensió cronològica de la vida.

Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo eucariota que se utiliza como modelo de estudio de las vías de transducción de señal implicadas en la respuesta a estrés oxidativo. Hasta el momento no se ha descrito la existencia de una ruta específica de señales de oxidación. Mtl1 es un miembro de la ruta CWI (Cell Wall Integrity: vía de integridad celular) que funciona como un sensor transmembrana que detecta el estrés oxidativo. En el presente estudio se demuestra que Mtl1 es esencial en el proceso de señalización del estrés oxidativo y quiescencia hacia la ruta CWI y hacia el factor general de respuesta a estrés Msn2/Msn4. En este último caso la señalización ocurre a través de Rom2 y Rho1 (y probablemente también a través de Pkc1) hacia la inhibición de las funciones Tor1 y Ras2. La función Mtl1 se requiere para: i) la represión de la trascripción de genes ribosomales, ii) la inducción del factor transcripcional Msn2/Msn4 y iii) activar la ruta CWI en respuesta a estrés oxidativo y ayuno de glucosa. En la segunda parte de la presente tesis se muestra que el dominio citoplasmático de Mtl1 interacciona físicamente con Rom2, la GEF (GTP Exchange Factor: factor intercambiador de GTP). Nuestros datos sugieren que la actividad Slt2 es importante para la supervivencia en condiciones de quiescencia. Sin embargo, Msn2/Msn4 contribuyen de manera más significativa a la supervivencia celular frente a condiciones oxidativas. Además, la ausencia de TOR1 o RAS2 es suficiente como para inducir la activación de Slt2 de manera independiente de Mtl1, en las condiciones de estrés mencionadas anteriormente. Todo ello sugiere que entre CWI, TOR y RAS-cAMP se establecen una serie de reacciones cruzadas encaminadas a asegurar que las células sean capaces de adaptar el crecimiento y su maquinaria metabólica de manera adecuada. Mtl1 se N-glicosila y se O-manosila, principalmente por la manosil transferasa Pmt2. Mtl1 se localiza preferentemente y de manera homogénea en la periferia celular, yema, septo y en la punta del shmoo. La manosilación de Mtl1 es importante para la localización de Mtl1 de manera regular en la periferia y en la punta del shmoo. La O-manosilación catalizada por Pmt2 en general, y en particular la O-manosilación de Mtl1, poseen una gran relevancia en: a) la respuesta a estrés oxidativo; b) frente al bloqueo en la ruta TOR; y c) la extensión cronológica de la vida.

The eukaryotic microorganism Saccharomyces cerevisiae serves as a model system in which to study the signal transduction pathways involved in the oxidative stress response. Up to date, there is no evidence of any MAPK cascade which is specific to oxidative signals. Mtl1 is a member of the CWI pathway, which functions as a cell wall sensor for oxidative stress. In the present study, we propose an essential role for Mtl1 in signalling oxidative stress and quiescence to the CWI pathway and to the general stress response through the inhibition of either Tor1 or Ras2 functions. The Mtl1 function is required i) to induce ribosomal gene repression, ii) to induce the general stress response driven by the transcription factor Msn2/Msn4, and iii) to activate the CWI pathway in response to both oxidative stress and glucose starvation. The signalling from Mtl1 to Tor1 and/or Ras2 inhibition under these conditions occurs through Rom2 and Rho1, and probably through Pkc1, at least that signal which target is the ribosomal gene expression. We demonstrate that the Mtl1 cytoplasmic domain physically interacts with the GEF Rom2. Our data indicate that Slt2 activity is really essential in terms of cell survival in quiescent conditions. However, in response to oxidative stress the contribution of Msn2/Msn4 function is more significant. In addition, we demonstrate that deletion of either TOR1 or RAS2 is sufficient to activate Slt2 upon the above mentioned stress conditions, independently on Mtl1. These data suggested that CWI, TOR and Ras-cAMP provide diverse cross talks in order to assure the cells to appropriately adapt metabolism and growth. We demonstrate that Mtl1 is N-glycosylated and highly O-mannosylated mostly by Pmt2 protein O-mannosyltransferase. Mtl1 localises to the cell periphery, the bud, the septum, and to the tip of the shmoo. Mtl1 O-mannosylation confers its proper localisation. We provide evidence for the importance of protein O-mannosylation in oxidative stress response, through at least Mtl1. This is the first report suggesting a role of protein Omannosylation in cell survival upon TOR blockage. Mtl1 O-mannosylation by Pmt2 is required to elicit cellular responses to TOR inhibition. Both Pmt2 and Mtl1 play positive roles in the chronological life span.