Selection Of Phototrophic Microorganisms For Use As Bioindicators Of Heavy Metals In Natural Environments. Optimization Of High-Resolution Microscopy Techniques

Abstract

En aquest treball s'ha determinat l'efecte i la capacitat de captació dels metalls pesants (Pb i Cu) per part de diferents microorganismes fotòtrofs i heteròtrofs, mitjançant tècniques microscòpiques d'alta resolució per tal de seleccionar microorganismes com a indicadors de contaminació per metalls. Per a aquest objectiu, han estat seleccionats diferents microorganismes fotòtrofs aïllats dels tapets microbians del delta de l'Ebre (un ecosistema declarat Parc Natural al 1983) i cianobacteris de la col.lecció de cultius Pasteur (PCC). Aquests tapets on dominen els microorganismes fotosintètics com els cianobacteris i les algues (productors primaris en aquests ecosistemes) poden patir contaminació per compostos tòxics com ara el petroli o els metalls pesants. En aquest treball, els metalls assajats per a la selecció de bioindicadors, han estat el plom (Pb) i el coure (Cu) donat que tots dos s'han detectat en el riu Ebre, i també perquè el primer és molt tòxic i no presenta cap funció biològica i el segon és en canvi un element essencial a baixes dosis i tòxic a elevades dosis. Per determinar la sensibilitat a un metall (tolerància-resistència), s'ha utilitzat la microscopia làser confocal acoblada a un detector espectrofluoromètric (CLSM-λscan). Els resultats demostren que Chroococcus sp. PCC 9106 i la microalga DE2009 presenten una major tolerància a Pb (0.5 mM) que Oscillatoria sp. PCC 7515 i Spirulina sp. 6313 (0,1 mM). Per determinar la biocaptació externa i interna del metall, s'ha utilitzat la microscòpia electrònica de rastreig (SEM), la microscòpia electrònica de transmissió (TEM) i el microanàlisi d'energia dispersiva per raigs X (EDX) acoblada a aquests dos microscopis. Els resultats indiquen que, tots els microorganismes utilitzats (tant els fotòtrofs com els heteròtrofs) tenen la capacitat d'acumular Pb i Cu externament en el seu EPS. Finalment, l'anàlisi de les seccions ultrafines (TEM-EDX) mostra que tots els microorganismes fotòtrofs estudiats acumulen Pb en les inclusions de polifosfat (PP). Per contra, els bacteris heteròtrofs tot i presentar aquestes inclusions, no acumulen cap dels dos metalls, ni en el citoplasma ni en les inclusions intracel·lulars. Una vegada provada l'eficàcia d'aquestes tècniques microscòpiques tant en els microorganismes aïllats de l'ambient natural com en els de col.lecció, s'ha realitzat el mateix tipus d'assajos en microcosmos, amb l'objectiu d'obtenir bons bioindicadors de contaminació per metalls, tenint com a objectiu final la seva aplicació en l'ambient natural. En aquests experiments s'ha assajat únicament el Pb, i s'ha comprovat que igual que en els cultius, els microorganismes més abundants seleccionats en aquest sistema artificial, Lyngbya-like i Phormidium-like (cianobacteris) tenen la capacitat d'acumular aquest metall tant externa com internament i sempre en inclusions de PP. Considerant tots els resultats obtinguts es podria concloure que tots els cianobacteris i la microalga DE2009 analitzats podrien ser considerats bons indicadors de contaminació per metalls. No obstant això, Oscillatoria sp. i Microcoleus sp. han estat seleccionats per ser: els més abundants en l'ambient natural, de major grandària, tolerants a elevades concentracions de metalls i finalment per la seva capacitat d'acumular-los extra i intracel·lularment.

In this work, the effect and capacity to capture heavy metals (Pb and Cu) of different phototrophic and heterotrophic microorganisms have been studied through high-resolution microscopy techniques in order to select microorganisms as metal pollution indicators. For this purpose, different phototrophic microorganisms isolated from Ebro Delta microbial mats (an ecosystem declared as Natural Park in 1983) and cyanobacteria from the Pasteur culture collection (PCC) have been selected. These mats, dominated by photosynthetic microorganisms like cyanobacteria and algae (primary producers in these habitats) can suffer pollution by toxic compounds such as oil or heavy metals. In this study, metals tested to select the bioindicators were lead (Pb) and copper (Cu), as both have been detected in the Ebro River, and also because the former is very toxic, showing no biological function, while the latter, by contrast, is an essential element at low doses, while at high doses it is toxic. To determine the sensitivity to a metal (tolerance-resistance), confocal laser microscopy coupled to a spectrofluorometric detector (CLSM-λscan) has been used. The results show that Chroococcus sp. PCC 9106 and DE2009 microalgae show greater tolerance to lead Pb (0.5 mM) than Oscillatoria sp. PCC 7515 and Spirulina sp. 6313 (0.1 mM). To determine the external and intracellular metal biocapture, scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM) and energy dispersive Xray microanalysis (EDX) coupled with these microscopes have been used, respectively. The results indicated that, all the microorganisms tested (both phototrophic and heterotrophic) have capacity to accumulate Pb and Cu externally in the EPS. Finally, the analysis of ultrathin sections (TEM-EDX) shows that all the phototrophic microorganisms studied accumulate Pb in the polyphosphate inclusions (PP). By contrast, although the heterotrophic bacteria show these inclusions, they do not accumulate either of the two metals either in cytoplasm or in intracellular inclusions. Once the effectiveness of these microscopy techniques has been shown both in microorganisms isolated from the natural environment and in those from the culture collection, the same tests have been carried out in microcosms in order to obtain good bioindicators of metal pollution, with the ultimate aim of applying them in the natural environment. In these experiments it has been shown that, as in cultures, the most abundant microorganisms selected in this artificial ecosystem, Lyngbya-like and Phormidium-like (cyanobacteria), have the capacity to accumulate this metal both externally and internally, always in PP inclusions. Considering all the results obtained it can be concluded that all cyanobacteria and DE2009 microalga analysed could be considered good metal pollution indicators. However, Oscillatoria sp. and Microcoleus sp. have been selected as the best indicators of metal pollution in the natural environment because: they are the most abundant, largest in size, tolerant to high concentrations of metals and, finally, capable of accumulating metal extra- and intracellularly.