Molecular and mechanistic characterization of a novel long non-coding RNA derived from NBL2 macrosatellite repeats in colorectal cancer

Abstract

DNA hypomethylation of repeats has been found in almost every tumor type studied. Hypomethylation of repetitive elements was shown to increase the likelihood of homologous recombination of these repeated sequences and thus contribute to genome instability. In our group we have found a macrosatellite repeat called NBL2 hypomethylated in a subset of colorectal cancers (CRCs). NBL2 somatic hypomethylation in CRC associated with genomic damage, especially in tumors having wild type P53. Here, we describe the genomic location of NBL2 by thorough in silico analysis, metaphase FISH and PCR on DNA from human-rodent somatic cell hybrids. We find that NBL2 repeats are dispersed on multiple chromosomes, however tandem arrays are placed close to centromers in the short arms of acrocentric chromosomes 13, 14, 15 and 21. Furthermore, we mechanistically addressed NBL2 transcription in an effort to elucidate the possible roles NBL2 RNA might have. We describe a novel lncRNA transcribed from NBL2 repeats upon DNA hypomethylation and histone acetylation only from chromosomes 13, 14, 15 and 21. We characterize NBL2 lncRNA as several high-molecular weight transcripts (4.2, 10 and 13 kb). By applying single molecule RNA FISH, we demonstrate those transcripts are retained in the nucleus, where they are widely distributed with preferential accumulation in the perinucleolar region. In order to study the molecular pathway in which NBL2 lncRNA might be involved, we analyzed its putative protein interacting partners by RNA affinity purification followed by proteomic analysis. We find that NBL2 RNA binds with high affinity to several proteins, mainly involved in RNA metabolism. Among those proteins is RNA binding protein CELF1 that regulates pre-mRNA splicing and mRNA stability/decay. Based on our results, we propose a model where, in addition to the contribution of somatic DNA hypomethylation of NBL2 repeats to genomic damage, NBL2 lncRNA contributes to instability by sequestering proteins involved in RNA metabolism, such as CELF1, consequently destabilizing their mRNA targets. NBL2 repeats may thus have a role in the generation of genomic instability underlying CRC pathogenesis by increasing cancer risk upon its somatic demethylation in cancer precursor cells, and/or by enhancing instability during tumor progression. The abnormal transcription of these repeats we observed in the form of NBL2 lncRNA may play a role in either or both of these pathways.

La hipometil·lació de l'ADN en elements repetitius s'ha trobat en gairebé tots els tipus de tumor estudiats. Aquesta hipometil·lació augmenta la probabilitat de recombinació homòloga d'aquestes seqüències repetides i per tant contribueix a la inestabilitat del genoma. El nostre grup ha descobert que un element macrosatèl.lit repetit en tàndem, anomenat NBL2 es troba desmetil.lat en un subgrup de càncers colorectals (CCR) i la seva hipometil.lació somàtica en el CCR s'associa amb el dany genòmic, especialment en tumors que no tenen mutat el gen de la P53. A continuació, es descriu la localització genòmica de NBL2 mitjançant una anàlisi in silico detallada, realitzant hibridacions de fluorescència in situ en metafases i monitorant per PCR la seva presència en l'ADN genòmic procedent de cèl.lules híbrides humanes / de rosegadors. Hem trobat que els elements NBL2 estan dispersos en diversos cromosomes, però les concatenacions en tàndem es troben a prop dels centròmers i més concretament en els braços curts dels cromosomes acrocèntrics 13, 14, 15 i 21. D'altra banda, s'ha caracteritzat la transcripció procedent de NBL2 i s'han intentat esbrinar les possibles funcions que l'ARN de NBL2 podria tenir en el context del CCR. Hem determinat l'existència d'un nou ARN llarg no codificant (lncRNA) que es transcriu quan el seu ADN es desmetil.la i presenta les seves histones acetilades només a partir dels cromsomes 13, 14, 15 i 21. La transcripció de l'element NBL2 genera tres lncRNA amb un d'alt pes molecular (4,2, 10 i 13 kb). Aquests transcrits són retinguts al nucli, en el qual s'acumulen preferencialment en la regió perinucleolar. Per tal d'estudiar les vies intracel.lulars on l'ARN de NBL2 podria estar involucrat, i determinar la seva possible funció, es va monitorar la seva interacció amb proteïnes realitzant una purificació per afinitat seguida d'una anàlisi proteòmica. Hem determinat que l'ARN de NBL2 s'uneix amb alta afinitat a diverses proteïnes implicades principalment en el metabolisme de l'ARN. Entre aquestes proteïnes destaca CELF1, una proteïna que regula el processament del pre-ARNm i l'estabilitat de l'ARNm. D'acord amb els resultats, es proposa un model en el qual, no només la hipometil.lació somàtica de l'ADN de NBL2 contribuiria al dany genòmic, sinó que també l'ARN de NBL2 podria jugar un paper pertorbador a través de segrestar proteïnes implicades en el metabolisme de l'ARN, com per exemple CELF1, i en conseqüència, desestabilitzar els seus ARNm diana. Així doncs, els elements repetits NBL2 podrien tenir un paper en la generació de la inestabilitat genòmica subjacent a la patogènesi del càncer de còlon per mitjà de l'increment del risc a causa d' una desmetil.lació somàtica present en les cèl.lules precursores del càncer, i/o afavorint la inestabilitat durant la progressió tumoral. La transcripció aberrant que hem observat a partir d'aquests elements NBL2 repetitius en forma de lncRNA podria contribuir en ambdues vies.