Expression of the Rhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris under the control of the FLD1 promoter

Abstract

Durant el curs d'aquest treball s'han realitzat l'expressió de la lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) sota en control del promotor FLD1 en el llevat Pichia pastoris i s'ha desenvolupat una estratègia de cultiu en semi-discontinu lliure de metanol. <br/>En primer lloc es va realitzar la construcció d'un vector d'expressió que conté el gen de la ROL i el promotor FLD1. Aquest vector va ser subseqüentment transformat a P. pastoris. Els cultius en discontinu en bioreactor van revelar l'efecte sinèrgic del metanol i la metilamina com a substrats inductors sobre el promotor FLD1. A més, l'ús de sorbitol com a font de carboni, combinat amb la metilamina, ha resultat ser una combinació atractiva per evitar l'ús de metanol en cultius a altes densitats cel·lulars.<br/>En segon lloc es va desenvolupar una estratègia de cultiu en semi-discontinu fent servir sorbitol i metilamina com a fonts de carboni i nitrogen respectivament. Es van dur a terme tres cultius a diferents velocitats específiques de creixement, 0.005 h-1, 0.01 h-1, i 0.02 h-1. El nivell més alt de proteïna recombinant es va obtenir al cultiu realitzat a 0.02 h-1. Malgrat això la velocitat específica de producció a tots tres cultius es va disminuir després d'arribar a un màxim a prop de les 30 hores de cultiu. <br/>Per tal d'analitzar els potencials colls d'ampolla al procés de plegament i secreció, i la possible activació de la resposta a estres per proteïnes mal plegades (UPR) durant l'expressió de ROL, es van analitzar els nivell de la xaperona BiP, indicativa d'estres. També es van analitzar els nivells intracel·lulars de ROL. Es va utilitzar la immunofluorescència, combinada amb la citometria de flux per analitzar els nivells d'aquestes proteïnes. El increment dels nivells intracel·lulars de BiP i ROL durant la fase d'inducció dels cultius va indicar una possible activació de la resposta d'estres.<br/>Es va proposar una estratègia d'enginyeria metabòlica per tal alleujar els possibles colls d'ampolla en la via de plegament i secreció. El gen HAC1 de Saccaromyces cerevisiae es va clonar i expressar constitutivament a les cèl·lules de P. pastoris co-expressant ROL. El gen HAC1 codifica per un factor de transcripció el qual és responsable de l'activació del gens relacionats amb el UPR. Els resultats dels cultius amb les soques que expressen constitutivament el gen HAC1 van mostrar un increment en els nivells d'expressió de ROL, demostrant l'efecte positiu sobre el plegament i la secreció d'aquesta modificació. <br/>Per altra banda, una segona modificació es va realitzar per a millorar l'eficiència de secreció. El gen GAS1, el qual codifica per a una glycoproteïna ancorada a la membrana plasmàtica la qual realitza els unions entre els ?-glucans de la paret cel·lular va ser disruptat. La deleció d'aquest gen va provocar un canvi a la conformació de la paret cel·lular, fent-la més permeable al pas de proteïnes, fet que va resultar en un increment en els nivells de ROL extracel·lular. <br/>També es va dur a terme l'estudi dels nivells de transcripció de determinats gens de d'interès rellevant de P. pastoris. Concretament es van quantificar els nivells de transcripció del gen de l'alcohol oxidasa (AOX1), la formaldehid deshidrogenase (FLD1), la protein disulfide isomerase (PDI), la proteina BiP (gen KAR2), el 26S rRNA, i el gen de la proteïna ROL. Els nivells de transcripció d'aquests gens es van quantificar fent servir el sandwich hybridization assay basat en la immobilització específica dels mRNAs sobre esferes magnètiques i la seva posterior detecció mitjançant fluorimetria. La velocitat específica de producció va resultar ser un factor clau en els nivells de transcripció dels gens analitzats; a més, els resultats van aportar noves evidencies que l'expressió de ROL activa la resposta a estres. <br/>Finalment, amb l'objectiu de determinar la localització intracel·lular a P. pastoris del producte recombinant, el gen de la ROL es va fusionar amb el de la green fluorescent protein d'Aequorea victoria. En cultius en discontinu els nivells d'expressió de la proteïna de fusió van ser deu vegades inferiors als del cultiu control expressant solament ROL. A més, es va observar que la fluorescència d'un producte associat al creixement de P. pastoris, probablement la riboflavina, es superposava al senyal de la GFP al medi extracel·lular. Per altra banda es va observar una acumulació intracel·lular de la proteïna de fusió localitzada a l'espai periplasmàtic i dins de compartiments cel·lulars amb aparença vacuolar. <br/>Aquest estudi ha permès el desenvolupament i la millora del sistema d'expressió de P. pastoris basant-se en l'ús del promotor FLD1 com a alternativa al clàssic AOX1.

During the course of this work, the expression of a Rhizopus oryze lipase (ROL) under the control of the FLD1 promoter in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, as well as the development of methanol-free cultivation processes and metabolic engineering strategies for process improvement has been carried out. <br/>First, an expression vector containing the ROL gene and the FLD1 promoter from P. pastoris was constructed and subsequently transformed in P. pastoris. Bioreactor batch cultivations revealed the synergetic effect of methanol and methylamine on the FLD1 promoter induction. Moreover, the use of sorbitol as carbon source, combined with methylamine as nitrogen source, was found to be an attractive alternative to the use of methanol for high cell density cultivations. <br/>Second, a new fed-batch fermentation strategy was developed using sorbitol and methylamine as carbon and nitrogen source, respectively. Three fed-batches were performed at different specific growth rates, 0.005 h-1, 0.01 h-1, and 0.02 h-1. The specific growth rate was controlled during induction phase in the 0.005 h-1, 0.01 h-1 fermentations by implementing an exponential feeding rate at limiting substrate concentration. The highest lipase productivity was obtained in the fed-batch performed at the 0.02 h-1 specific growth rate. However, product production rate of all three fermentations dropped soon after reaching a maximum at about 30 hours of culture. <br/>Third, in order to analyze potential bottlenecks in the protein folding or secretion pathway and, in particular, the potential activation of the unfolded protein response (UPR) during ROL overexpression and intracellular accumulation, the levels of a reticle endoplasmatic-resident chaperone (BiP), its induction has been related to the activation of the UPR, as well as the intracellular levels of ROL were analyzed by immunofluorescence staining combined with flow cytometry. The increase of BiP and ROL levels during the induction phase of fed-batch cultivations indicated the possible activation of the UPR. <br/>Fourth, a metabolic engineering strategy was proposed to alleviate the supposed bottleneck in the folding and secretion pathway. The Saccharomyces cerevisiae HAC1 gene was cloned and constitutively expressed in P. pastoris co-expressing ROL. The HAC1 gene codifies for a transcriptional factor which activates the UPR related genes expression. The constitutively activation of the UPR was aimed at sustaining a better protein folding and secretion efficiency. Results from the HAC1-engineered strain showed an increase in the product expression, demonstrating the positive effect of such modification on protein folding and secretion.<br/>Besides, a transcriptional analysis of some bioprocess-relevant genes of the ROL-expressing P. pastoris strains was carried out. In particular, the alcohol oxidase 1 (AOX1), formaldehyde dehydrogenase (FLD1), protein disulfide isomerase (PDI), binding protein (KAR2), 26S rRNA and the recombinant product (ROL) mRNA levels were monitored in both shake flask and fed-batch cultivations. The mRNA levels of these genes were quantified by using a sandwich hybridization assay based on immobilization of the desired mRNA on magnetic beads and subsequent detection by a fluorescence-based technique. The specific growth rate showed to be a key factor in the transcriptional level of the analyzed genes; moreover, the results gave additional evidence to the hypothesis that ROL triggers the UPR. <br/>Fifth, a second genetic modification was carried out in order to improve the secretion efficiency of ROL. The P. pastoris GAS1 gene, which codifies for a glycoprotein anchored to the outer layer of the plasma membrane performing cross links between the cell wall ?-glucans, was disrupted. The deletion of this gene provoked a change in the cell wall conformation, causing an increase of the cell wall porosity and permeability, i.e. allowing for a better release of the recombine product. <br/>Finally, in order to gain further insights on the potential accumulation of the recombinant product, ROL gene was fused with the Aequorea victoria green fluorescence protein (GFP) gene and expressed in P. pastoris. In batch culture the expression of the ROL as a fusion protein caused an important decrease in the extracellular levels of the recombinant lipase activity when compared with the control. Also, the presence of growth-related product, probably riboflavin, was found to interfere with the extracellular GFP signal. Besides, an intracellular accumulation of the fusion protein was observed both in the cell's periplasm and in vacuolar-like compartments. <br/>Overall, this study has allowed the development and improvement of the P. pastoris expression system based on the formaldehyde deshydrogenase promoter as an alternative to the classic methanol inducible alcohol oxidase promoter.