Biodegradació d'hidrocarburs alifàtics clorats per fongs ligninolítics

Abstract

El tricloroetileno (TCE) y percloroetileno (PCE) son dos hidrocarburos alifáticos clorados ampliamente usados en la industria como disolventes, que se encuentran entre los contaminantes más habituales en suelos y aguas subterráneas en el mundo. <br/>En esta Tesis se demuestra la capacidad de degradación de TCE por diferentes especies de hongos de podredumbre blanca, como Trametes versicolor, Irpex lacteus y Ganoderma lucidum. Phanerochaete chrysosporium se ha incluido en estos estudios como control positivo, ya que previamente se había demostrado su capacidad para mineralizar TCE. Nuestros resultados, en consonancia con algunos estudios publicados recientemente, muestran que P. chrysosporium alcanza valores de degradación más bajos en medios con bajo contenido en nitrógeno que en medio de extracto de malta, en los que la producción de peroxidasas se encuentra completamente suprimida. Este estudio constituye la primera demostración de la capacidad de G. lucidum para degradar compuestos xenobióticos. Dado que los porcentajes de degradación son sustancialmente superiores en los cultivos con T. versicolor, se ha escogido este hongo para posteriores experimentos. <br/>Se ha identificado al dióxido de carbono y al 2,2,2-tricloroetanol como subproductos de degradación de TCE por T. versicolor, usando [13C]-TCE como sustrato. El balance de cloruros realizado indica que la mitad del TCE degradado se mineraliza, y la otra mitad restante se acumula en forma de 2,2,2-tricloroetanol. El 2,2,2-tricloroetanol no está considerado cancerígeno, y ésta es una ventaja comparativa respecto a los subproductos típicos de acumulación en el caso de las bacterias. <br/>Se ha obtenido un porcentaje de degradación elevado (aprox. 80%) para el rango de 2-10 mg/l de TCE. Incrementando la concentración de glucosa en el medio y reoxigenando los cultivos durante la incubación, se obtiene una mayor generación de cloruros en la degradación de TCE, lo que indica una mayor mineralización del producto. <br/>El TCE resultó ser un inductor de la producción de lacasa para T. versicolor, pero los experimentos realizados in vitro indican que ni la lacasa ni un amplio espectro de mediadores testados son capaces de oxidar el TCE. Experimentos realizados con el inhibidor del citocromo P450, 1-aminobenzotriazol, indican que este sistema oxidativo juega un papel clave en la degradación de TCE. Se ha identificado al cloral (tricloroacetaldehido) como intermediario en la vía de degradación de TCE. Por último, se ha propuesto una vía de degradación de TCE para T. versicolor.<br/>Por otro lado, se ha demostrado por primera vez la capacidad de un hongo para degradar PCE aeróbicamente. En cultivos de T. versicolor con 5 mg/l de PCE se consigue un 40% de degradación. Se ha identificado al ácido tricloroacético (TCA) como principal subproducto usando [13C]-PCE como sustrato. La generación de cloruro y el TCA producido mantienen una relación estequiométrica con el PCE degradado. Experimentos realizados con el inhibidor 1-aminobenzotriazol indican que el citocromo P450 está implicado en la degradación de PCE por T. versicolor. Los cultivos reoxigenados muestran tan solo un ligero aumento de los niveles de degradación, liberación de cloruros y generación de TCA. A partir de los resultados obtenidos, se sugiere una vía de degradación de PCE por T. versicolor, que es análoga a la descrita en los mamíferos. <br/>Finalmente, se ha realizado una aproximación de los principales factores que pueden influenciar en el tratamiento real de aguas contaminadas por TCE y PCE mediante biorreactor. T. versicolor degrada un 34,1 y 47,7% del PCE (5 mg/l) y TCE (10 mg/l), respectivamente, añadido conjuntamente a los cultivos. El porcentaje de degradación, así como los cloruros liberados en este experimento, indican que el hogo degrada mezclas de estos productos con la misma eficiencia que lo hace para el TCE y PCE añadido individualmente. La ecuación de Michaelis-Menten es la que presenta un mejor ajuste de las cinéticas de degradación de TCE y PCE, para un amplio rango de concentraciones testadas. Por último, se ha establecido que la isoterma de Freundlich es la que mejor describe el equilibrio de adsorción entre la biomasa y los disolventes clorados, mediante controles de T. versicolor autoclavados. Se ha validado esta isoterma con experimentos de degradación, obteniendo un buen ajuste entre los valores experimentales y los simulados.

Trichloroethylene (TCE) and perchloroethylene (PCE) are chlorinated aliphatic hydrocarbons which have been widely used in industrial cleaning solutions. These xenobiotic compounds are among the most common organic pollutants found in groundwater around the world. <br/>In this thesis, the ability of several species of white-rot fungi, including Trametes versicolor, Ganoderma lucidum and Irpex lacteus, to degrade substantial levels of TCE in pure cultures was demonstrated. P. chrysosporium, included as a positive control in this study, was previously shown to mineralize TCE. Our results, in conformation with earlier studies, showed that P. chrysosporium exhibits lower TCE degradation in low nitrogen medium than in malt extract medium, in which peroxidases are known to be completely suppressed. As far as we know, it was the first demonstration of the ability of G. lucidum to degrade a xenobiotic pollutant. Since the extent of TCE degradation by T. versicolor was substantially greater than that shown by the other fungi, it became the obvious choice for further study. <br/>Carbon dioxide and 2,2,2-trichloroethanol were identified as the byproducts generated during the degradation of TCE by T. versicolor using [13C]-TCE as the substrate. The chloride balance indicated that one half of the TCE degraded is mineralized and the remaining TCE tends to accumulate as 2,2,2-trichloroethanol. Unlike TCE, 2,2,2-trichloroethanol is not considered carcinogenic and this is a distinct advantage in comparison to bacterial systems. <br/>A high percent of degradation (aprox. 80%) was observed for a range of concentrations between 2-10 mg/l. A highest chloride release from TCE degradation occurred by increasing the glucose concentration in the media and reoxygenating cultures during incubation. <br/>Our results showed that TCE was an inducer of laccase production in T. versicolor, but in vitro experiments showed that neither laccase nor any of the wide array of mediators tested were able to cause oxidation of TCE. Cytochrome P450 appeared to play a key role in TCE degradation, as evidenced by means of cytochrome P450 inhibition experiments using 1-aminobenzotriazole, a known cyt. P450 inhibitor. Chloral (trichloroacetaldehyde) was identified as an important intermediate of the TCE degradation pathway. Finally, a TCE degradation pathway by T. versicolor is suggested. <br/>On the other hand, the ability of a fungus to degrade PCE under aerobic conditions was demonstrated for the first time. Approximately, a 40% of degradation was achieved in cultures of T. versicolor spiked with 5 mg/l of PCE. Trichloroacetic acid (TCA) was identified as the main intermediate using [13C]-PCE as the substrate. Chloride released and TCA produced were stoichiometric with PCE degradation. Our studies using the inhibitor 1-aminobenzotriazole, suggested that a cytochrome P-450 system may be involved in PCE degradation by T. versicolor. Cultures that were re-oxygenated showed slightly higher levels of degradation, chloride release and TCA generation, but not as much as one would have expected. Finally, a degradation pathway was suggested, which was analogous to that described in mammalian systems. <br/>Finally, an approach of some of the factors which may influence the treatment of real TCE and PCE contaminated waters by T. versicolor using a bioreactor was studied. The fungus degraded 34.1 and 47.7 percent of PCE and TCE added as a mixtures (containing 5 and 10 mg/l, respectively). Percent degradation as well as chloride release from mixtures of TCE and PCE showed that T. versicolor degrades these mixtures as well as individually added TCE or PCE. A Michaelis-Menten kinetic equation related to TCE and PCE degradation was obtained with TCE degradation experiments for a wide range of concentrations. Finally, it was considered that Freundlich isotherm described the adsorption equilibrium between biomass and the chlorinated solvents, using heat-killed controls. This isotherm was validated in degradation conditions, obtaining a correct adjustment between the experimental and the simulated data.