Estratègies genètiques per a la inhibició de l'apoptosi en cultius in vitro d'hibridomes

Abstract

En l'actualitat, la indústria farmacèutica utilitza la tecnologia basada en el cultiu in vitro de cèl·lules animals per a la producció de compostos d'elevat interès terapèutic i també, com a model biològic per assajar l'activitat de nous fàrmacs. Moltes empreses fan ús d'aquesta tecnologia ja que es tracta del sistema biològic més apropiat per obtenir proteïnes complexes. Tot i així, pel que fa l'ús de cèl·lules animals, existeixen una sèrie de limitacions importants, ja que s'ha comprovat que una gran part de les cèl·lules presents en aquests cultius moren per apoptosi. <br/>La principal causa d'aquest tipus de mort és l'esgotament de determinats nutrients essencials o factors de creixement i l'acumulació de metabòlits tòxics per a la cèl·lula. L'apoptosi representa un greu inconvenient a nivell del cultiu in vitro en bioreactors, ja que disminueix dràsticament la viabilitat del cultiu i en conseqüència, la productivitat del bioreactor.<br/>En el present treball, s'han utilitzat les eines que proporciona la biologia molecular per tal de modificar les cèl·lules, fent-les més resistents al procés d'apoptosi. L'objectiu final és aconseguir cèl·lules que mantinguin la viabilitat durant més temps, tot i que en el medi de cultiu es donin senyals per iniciar l'apoptosi. D'aquesta manera es milloraria la productivitat i l'eficiència d'aquests processos. <br/>En aquesta tesi doctoral s'han proposat dues estratègies d'inhibició genètiques, una que consisteix en inhibir l'actuació de les Caspases, proteïnes claus en el procés d'apoptosi, i l'altra que es centra a nivell del mitocondri, punt on conflueixen els diferents senyals apoptòtics d'origen intracel·lular. <br/>Entre els diferents gens assajats, els resultats més positius s'han obtingut amb la proteïna BHRF-1. En canvi, l'expressió de la proteïna P35 no ha permès protegir les cèl·lules enfront l'apoptosi. Gràcies a l'expressió del gen bhrf-1 és possible retardar la mort per apoptosi dels cultius cel·lulars, augmentant així la productivitat del procés, i garantir la supervivència de les cèl·lules sotmeses durant 72 hores a condicions inductores de l'apoptosi, ja sigui per raons accidentals o per situacions de limitació de nutrients o acumulació de metabòlits tòxics.<br/>També s'ha observat que després d'un cert període de manteniment de la resembra, les cèl·lules transfectades perden la capacitat de protegir-se contra l'apoptosi, ja que l'expressió del gen antiapoptòtic s'acaba silenciant. Per aquest motiu, es necessari l'ús de vectors que expressin el gen d'interès al llarg del temps. Els resultats obtinguts han demostrat que els vectors bicistrònics són una bona eina per modificar genèticament les cèl·lules animals ja que per una banda, permetent una integració adequada del fragment de DNA clonat i per l'altra que les modificacions genètiques realitzades perdurin al llarg de temps sense la necessitat d'exercir una selecció constant amb antibiòtic, aspecte molt important sobretot quan s'opera en bioreactors durant períodes molt llarg de temps i es treballa amb volums propis d'un bioreactor. <br/>En els cultius en perfusió s'ha vist que l'expressió del gen antiapoptòtic bhrf-1 permet reduir considerablement el nombre de cèl·lules mortes en el cultiu, tot mantenint la densitat de cèl·lules viables. Aquest fet és molt important, ja que es pot allargar la durada del cultiu i en conseqüència, augmentar els nivells de producció del procés. També s'ha observat que aquesta disminució de cèl·lules mortes coincideix amb un alentiment del cicle cel·lular dels hibridomes, suggerint que probablement la proteïna BHRF-1 actua directament sobre el cicle cel·lular i no sobre la via mitocondrial, ja que semblaria que, en condicions anòmales (limitació de nutrients), afavoreix l'entrada de les cèl·lules a l'estat de quiescència (fase G0), la qual cosa impediria l'activació de l'apoptosi.

Nowadays, the pharmaceutical industry uses the in vitro animal cell culture technology for the production of biologicals of therapeutic interest and as a model to test the activity of new drugs. It constitutes the most appropriate system to obtain complex proteins with biological activity. Nevertheless, animal cell culture has certain limitations, such as the early termination of cultures when cells activate the apoptotic program. The depletion of essential nutrients and growing factors in the medium, or increased concentrations of toxic metabolites, are common the cause for cell death. Therefore, the activation of apoptosis in bioreactors seriously compromises the productivity of the bioreactor.<br/>In this work, hybridoma cells were genetically engineered in order to make them more resistant to apoptosis under cell culture conditions. The goal was to increase viability of cultured cells, even under adverse apoptosis-inducing conditions, in order to improve productivity of such processes. Two different strategies of genetic inhibition were adopted: inhibition of Caspase activity, and overexpression of antiapoptotic members of the Bcl-2 family.<br/>From all genes tested, the best results were obtained with the one that expresses the protein BHRF-1. Otherwise, expression of the baculoviral P35 did not protect cells against apoptosis. Cell cultures expressing gene bhrf-1 lengthened its survival period up to 72 hours when submitted to adverse conditions leading to apoptosis. In this way death due to apoptosis was retarded when nutrients were limited or toxic metabolites accumulated in the medium; or when eventual mechanical incidents occurred. Therefore, the efficiency of the process resulted improved. <br/>After several passages in culture, transfected cells lost their capacity to protect themselves from apoptosis, which was attributed to the silencing of antiapoptotic gene expression. For this reason, the hybridoma cells were genetically engineered with bicistronic vectors (containing an IRES element) encoding the gene of interest and a selection marker. This strategy permitted stable expression for large passage number and, moreover, long-term expression of the antiapoptotic genes even in absence of selective pressure. This is of especial importance when operating large bioreactors for long operational periods of time.<br/>In perfusion cultures, cultures of cells expressing the antiapoptotic gene bhrf-1 exhibited reduced the number of dead cells and maintained, at the same time, the number of viable cells. This is an important achievement because it allows to lengthen the duration of the cell culture and, consequently, to increase productivity. It was also observed that this decrease in the number of dead cells coincided with a slowing down of the cellular cycle of the hybridomas, suggesting that protein BHRF-1 has a direct effect on the cellular cycle rather than in the mitochondrial pathway. It seems that in anomalous conditions (nutrient restriction) this expression facilitates the switch of the cells to a quiescent stage (phase G0), preventing apoptosis.