Avances en el desarrollo de bioprocesos: adición aldólica catalizada por ramnulosa-1-fosfato aldolasa recombinante

Abstract

En la actualidad existe un creciente interés en el desarrollo de procesos industriales biocatalíticos eficientes desde el punto de vista económico y medioambiental. Uno de los procesos más prometedores para la industria es la biocatálisis de la formación de enlaces C-C para la producción de compuestos de estereoquímica definida, de aplicación en diversos campos y, en especial, en la industria farmacéutica.<br/>El presente trabajo de Tesis Doctoral es una aportación al desarrollo de un bioproceso catalítico empleando ramnulosa-1-fosfato aldolasa recombinante como biocatalizador para la producción estereoselectiva de un compuesto precursor de inhibidores de glicosidasas de acción terapéutica mediante adición aldólica de dihidroxiacetona fosfato y (S)-Cbz-alaninal.<br/>En primer lugar, se ha procedido a la obtención de un modelo cinético de la reacción catalizada por la enzima soluble en un medio acuoso con dimetilformamida como cosolvente para permitir la disolución simultánea de ambos reactivos. Este modelo cinético incluye la reacción secundaria de degradación enzimática de dihidroxiacetona fosfato que tiene lugar paralelamente a la reacción de síntesis.<br/>En segundo lugar, y con el fin de aumentar la estabilidad de la enzima y mejorar la operación en biorreactor, se estudió la inmovilización de la enzima en dos tipos de soportes: soportes de afinidad metálica y nanopartículas de oro. El primer soporte permite realizar la purificación e inmovilización en un solo paso de la enzima, con el consiguiente ahorro de etapas y aumento del rendimiento global del proceso. El segundo tipo de soporte permite reducir las limitaciones difusionales que aparecen con frecuencia en los soportes porosos convencionales y obtener elevadas cargas enzimáticas específicas. Los biocatalizadores inmovilizados por ambas técnicas se emplearon en la catálisis de la adición aldólica de interés en un medio acuoso con dimetilformamida como cosolvente, evaluando su estabilidad en el medio.<br/>Por último, se estudiaron otras estrategias de reacción para mejorar la solubilidad simultánea de los reactivos de la reacción. Por un lado se analizó el empleo de novedosos medios de reacción, los líquidos iónicos, como alternativa al empleo de cosolventes orgánicos en la biocatálisis de interés. Por otro lado, se evaluó la aplicación de un biorreactor de membrana empleando un medio bifásico acuoso/orgánico en el mismo sistema biocatalítico.

Nowadays, there is a growing interest in the development of efficient industrial bioprocesses from an economic and environmental point of view. One of the most promising processes for the industry is the biocatalytic C-C bond formation that yields compounds with defined stereochemistry for diverse applications, especially in the pharmaceutical industry.<br/>This PhD Thesis is a contribution to the development of a catalytic bioprocess for the production of precursors of compounds with therapeutic potential as inhibitors of glycosidases for a wide range of diseases. The biocatalytic reaction employed was the aldol addition between dihydroxyacetone phosphate and (S)-Cbz-alaninal using recombinant rhamnulose-1-phosphate aldolase as biocatalyst.<br/>First, a kinetic model for the aldol addition catalyzed by soluble enzyme was obtained. The reaction was carried out in an aqueous medium with dimethylformamide as a cosolvent in order to achieve a suitable solubility of both reactants. This kinetic model includes the secondary reaction of enzymatic degradation of dihydroxyacetone phosphate that takes place simultaneous to the synthetic reaction.<br/>Secondly, enzyme immobilization was studied with the aim of increasing enzyme stability and improving bioreactor operation. Two types of supports were used: metal-chelated supports (IMAC) and gold nanoparticles. The use of metal-chelated supports allows simultaneous purification and immobilization in only one-step, reducing the number of steps of the process and increasing the global yield. Gold nanoparticles as supports for enzyme immobilization allow obtaining high enzymatic loads due to its high surface-to-volume ratio. Moreover, the diffusional limitations that frequently appear while working with conventional porous supports can be also reduced. Immobilized biocatalysts were produced by both immobilization techniques and they were applied in the biocatalysis of the selected aldol addition in an aqueous medium with dimethylformamide as a cosolvent. The stability of these biocatalysts in the reaction conditions was determined as well.<br/>Finally, other reaction strategies were employed in order to improve the simultaneous solubility of dihydroxyacetone phosphate and (S)-Cbz-alaninal. Ionic liquids, considered as promising reaction solvents, were assessed as an alternative to organic cosolvents in the selected biocatalysis. On the other hand, a membrane bioreactor with an aqueous/organic biphasic medium with high solubility of both substrates was studied with the same biocatalytic system.