Use of fungi and bacteria for the removal of recalcitrant compounds from tannery wastewater

Abstract

Els tanins són polifenols produïts per plantes que s'utilitzen en l'adobat vegetal. Aquests es diferencien de la majoria dels fenols naturals perquè fan precipitar les proteïnes i s'utilitzen en el procés d'adobament per unirse a les proteïnes del col·lagen de la pell de l'animal, fent que el cuir sigui més durador. Es tracta d'una substància de baixa biodegradabilitat, amb una elevada demanda química d'oxigen soluble. A més, la presència d'aquests tanins en grans concentracions poden inhibir el tractament biològic. Generalment aquest fragment soluble i inflexible dels efluents de les adoberies s'elimina mitjançant processos químics. Es per això que un tractament biològic que pogués eliminar-los eficaçment tindria avantatges tant ambientals com econòmics. D'aquesta manera els fongs podrien ser utilitzats al tractament d'aigües residuals d'aquest tipus d’indústria. Tot i així continua sent un desafiament important l'aplicació d'un bioreactor a base de fongs que, en operacions a llarg termini, tingui un rendiment similar en condicions estèrils i no estèrils. La present tesi s'ha centrat en desenvolupar i testejat diverses tècniques amb l'objectiu d'eliminar els tanins. Es fa mitjançant la creació d'un ecosistema dissenyat a base de fongs i bacteris. Aquest s'aplica a processos típics de tractament d'aigües residuals d'adoberies. Aspergillus tubingensis MUT 990 ha sigut la soca fúngica més adequada. S'han fet servir tant recerques bibliogràfiques com la pròpia experiència prèvia per dissenyar i construir reactors a escala laboratori (4 litres) i a escala pilot (1.5 m3). La soca fúngica es va immobilitzar en portadors cúbics i es va inocular en un nou reactor giratori de llit submergit. La primera prova en bioreactors es va dur a terme per avaluar l'efecte de la rotació i l'efecte de l'addició del co-substrat en l'eliminació dels tanins. La segona prova es va realitzar de forma paral·lela en dos reactors de llit submergit fix; el primer es va alimentar amb un taní condensat (Quebracho) i el segon amb un taní hidrolitzable (Tara). Tots dos es van inocular amb Aspergillus tubingensis. El temps de retenció hidràulic i la concentració de tanins en el medi es van anar modificant per maximitzar la capacitat d'eliminació i per analitzar la inhibició del substrat. Es va mantenir estable un biofilm en el primer reactor durant 180 dies d'operació. D'altra banda, en el segon reactor va haver un despreniment de biomassa durant la posada en marxa; després va créixer com un cultiu suspès durant el període operatiu (226 dies). L'eliminació de la demanda d'oxigen soluble va ser, sense l'addició de co-substrats, de fins el 53% i 90% en el primer i segon bioreactor respectivament. Les comunitats microbianes formades per fongs i bacteris dels reactors es van caracteritzar amb un anàlisi d'ADN. A més es va aplicar la respirometria heterogènia per avaluar l'activitat biològica del biofilm. Les dades obtingudes es van utilitzar per desenvolupar un model matemàtic i realitzar una caracterització cinètica i estequiomètrica de la biomassa. Es van establir experiments específics juntament amb un procediment respiromètric per a la biomassa fúngica. Els resultats a escala de laboratori es van utilitzar per dissenyar un reactor a escala pilot. Finalment, després d'una fase de posada en marxa, el reactor a escala pilot es va alimentar amb aigües residuals riques en tanins recollides d'adoberies. Al final de l'experiment, el biofilm era estable i s'havia aconseguit un exercici encoratjador. Creiem que els resultats obtinguts representen el primer pas per a una futura aplicació a escala real i aconseguir eficientment l'eliminació biològica de tanins en aigües residuals d'adoberies.

Los taninos son compuestos polifenólicos producidos por plantas que se utilizan en el curtido vegetal. Los taninos se diferencian de la mayoría de los fenoles naturales porque precipitan las proteínas y se usan en el proceso del curtido para unirse a las proteínas del colágeno de la piel del animal para hacer que el cuero sea más duradero. Representan una de las sustancias de baja biodegradabilidad en las aguas residuales de la curtiduría con una alta y recalcitrante demanda química de oxígeno soluble. Además en grandes concentraciones, dichos taninos pueden inhibir el tratamiento biológico. Este fragmento soluble y inflexible de los efluentes de las curtiduría generalmente se elimina mediante procesos químicos. Por tanto, un tratamiento biológico que pudiera eliminarlos eficazmente, tendría ventajas tanto ambientales como económicas. Los hongos podrían ser utilizados para el tratamiento de aguas residuales de la industria del curtido. La aplicación de un bioreactor a base de hongos que tenga un rendimiento similar en condiciones estériles y no estériles en operaciones de largo plazo sigue siendo una tarea desafiante. La presente tesis se ha centrado en desarrollar y probar técnicas para eliminar los taninos con un ecosistema diseñado a base de hongos y bacterias para su aplicación en trenes típicos de tratamiento de aguas residuales en las curtidurías. El Aspergillus tubingensis MUT 990 fue seleccionado como la cepa fúngica adecuada. La investigación bibliográfica y las experiencia previa se utilizó para diseñar y construir reactores a escala de laboratorio (4 litros) y piloto (1.5 m3). La cepa fúngica se inmovilizó en portadores cúbicos y se inoculó en un nuevo reactor giratorio de lecho sumergido. La primera prueba en bioreactores se llevó a cabo para evaluar el efecto de la rotación y la adición del co-sustrato en la eliminación de los taninos. La segunda prueba se realizó de forma paralela en dos reactores de lecho sumergido fijo; el primero se alimentó con un tanino condensado (Quebracho) y el segundo con un tanino hidrolizable (Tara). Ambos se inocularon con el Aspergillus tubingensis. El tiempo de retención hidráulico y la concentración de taninos en el medio se fueron variando para maximizar la capacidad de eliminación y para analizar la inhibición del sustrato. Se mantuvo estable una biopelícula en el primer reactor durante 180 días de operación. Por otro lado, en el segundo reactor hubo un desprendimiento de biomasa durante la puesta en marcha y luego creció como un cultivo suspendido durante el período operativo (226 días). La eliminación de la demanda de oxígeno soluble fue hasta del 53% y del 90% y se logró en el primer y en el segundo bioreactor respectivamente sin la adición de co-sustratos. Las comunidades microbianas de los reactores formadas por hongos y bacterias se caracterizaron con un análisis de ADN. Además se aplicó la respirometría heterogénea, para evaluar la actividad biológica de la biopelícula. Los datos obtenidos se utilizaron para desarrollar un modelo matemático y realizar una caracterización cinética y estequiométrica de la biomasa. Se establecieron experimentos específicos junto con un procedimiento respirométrico para la biomasa fúngica. Los resultados a escala de laboratorio se utilizaron para diseñar un reactor a escala piloto. Finalmente, después de una fase de puesta en marcha, el reactor a escala piloto se alimentó con aguas residuales ricas en taninos recolectadas en las curtiembres. Al final del experimento, la biopelícula era estable y se había logrado un desempeño alentador. Creemos que los resultados obtenidos representan el primer paso para una futura aplicación a escala real y lograr eficientemente la eliminación biológica de los taninos en las aguas residuales de las curtidurías.

I tannini sono composti polifenolici prodotti dalle piante e sono utilizzati nella concia al vegetale a scala industriale. I tannini si differenziano dalla maggior parte degli altri composti fenolici naturali per la loro capacità di far precipitare le proteine ​​e sono utilizzati nel processo di concia per legarsi al collagene delle pelli animali, al fine di renderle più resistenti e non putrescibili. I tannini sono una delle sostanze solubili a bassa biodegradabilità presenti nelle acque di scarico della concia e presentano un’elevata domanda chimica di ossigeno recalcitrante. Inoltre, ad elevate concentrazioni possono inibire i trattamenti biologici. Questa frazione recalcitrante e solubile delle acque di scarico della concia è solitamente rimossa tramite processi chimici. Pertanto, un trattamento biologico in grado di rimuovere efficacemente questa frazione presenterebbe vantaggi sia ambientali che economici. Nonostante le proprietà antimicrobiche dei tannini, esistono organismi in grado di usarli come substrato di crescita, la loro biodegradazione nell'ambiente è principalmente associata ai funghi piuttosto che ai batteri. I funghi quindi possono essere sfruttati per il biorisanamento delle acque reflue dell'industria conciaria. Tuttavia, in questa tipologia di biotecnologie ambientali, i funghi non riescono a competere con batteri. L'utilizzo di un bioreattore fungino, con simili prestazioni in condizioni sterili e non sterili in prove a lungo termine, rappresenta ancora un compito impegnativo. La presente tesi si è focalizzata nello sviluppo e sperimentazione di tecnologie atte a rimuovere i tannini sfruttando un ecosistema di funghi e batteri, il fine ultimo è stato quello di sviluppare un trattamento da integrare a quelli convenzionali per le acque reflue (condizioni non sterili). Il ceppo fungino Aspergillus tubingensis MUT 990 è stato selezionato come il più adatto per il presente studio. La letteratura di settore e le esperienze precedenti hanno fornito un importante contributo per la progettazione e costruzione dei reattori a scala di laboratorio (4 litri) e un reattore a scala pilota (1.5 m3). Il ceppo fungino selezionato è stato immobilizzato in supporti costituiti da cubi di schiuma poliuretanica ed è stato inoculato in un innovativo reattore a letto rotante e sommerso. La prima prova con i bioreattori ha avuto il fine di valutare l'effetto della rotazione e dell'aggiunta del co-substrato sulla rimozione del tannino. La seconda prova è stata effettuata in parallelo in due reattori, il primo è stato alimentato con un tannino condensato (Quebracho) e il secondo con tannino idrolizzabile (Tara), entrambi sono stati inoculati con Aspergillus tubingensis immobilizzato sul supporto sopradescritto. Il tempo di ritenzione idraulico e la concentrazione di tannino sono stati i principali parametri studiati per massimizzare la capacità di rimozione e per analizzare l'inibizione del substrato. Nel primo reattore si è mantenuto un biofilm stabile durante i 180 giorni di funzionamento. Nel secondo reattore invece si è verificato un distacco del biofilm e lo sviluppo di una biomassa in sospensione per tutto il periodo sperimentale (226 giorni). Nel primo reattore è stata raggiunta una rimozione della domanda chimica di ossigeno solubile del 53% e nel secondo reattore del 90%, in entrambi senza l'aggiunta di co-substrati. Le comunità microbiche dei reattori, costituite da funghi e batteri, sono state caratterizzate da un'analisi metagenomica. Inoltre, è stata applicata una tecnica innovativa, la respirometria eterogenea, per valutare l'attività biologica del biofilm. I dati ottenuti sono stati utilizzati per sviluppare un modello matematico e per eseguire una caratterizzazione dei parametri cinetici e stechiometrici della biomassa. Poiché in letteratura la respirometria e la modellistica sono scarsamente applicate alle biomasse fungine è stata messa a punto una procedura respirometrica ed esperimenti dedicati. I risultati delle prove di laboratorio sono stati impiegati per la progettazione del reattore a scala pilota. Infine, dopo una fase di avviamento, il reattore a scala pilota è stato alimentato con refluo conciario contenente un’elevata concentrazione di tannini. Al termine della sperimentazione il biofilm è rimasto stabile mostrando una buona capacità di rimozione. I risultati ottenuti rappresentano il primo passo per una futura applicazione, su scala reale, di efficace trattamento biologico delle acque reflue conciarie.

Tannins are polyphenolic compounds produced by plants that are used in the vegetable tanning of leather at an industrial scale. Tannins differ from most other natural phenols since they precipitate proteins and are used in the tanning process to bind to the collagen proteins of the animal skin to make leather more durable and not putrescible. Tannins represent one of the low-biodegradability substances in tannery wastewaters with a highly recalcitrant soluble chemical oxygen demand; moreover, at high concentrations they can inhibit biological treatment. This soluble recalcitrant fraction of tannery effluents is usually removed by means of chemical processes. Therefore, a biological treatment that could remove effectively this fraction would have both environmental and economic advantages. Despite the antimicrobial properties of tannins, there are organisms that are able to grow on them; in fact their biodegradation in the environment is mainly associated with fungi rather than bacteria. Fungi could thus be exploited for the bioremediation of wastewater streams of the tanning industry. However, in environmental biotechnology applications, fungi tend to be outcompeted by bacteria. The application of a fungal-based bioreactor, that has a similar performance under sterile and non-sterile conditions in long-term operations, is still a challenging task. The present thesis was aimed at developing and testing technologies to remove tannins with an engineered ecosystem based on fungi and bacteria for application in typical tannery wastewater treatment trains (non-sterile conditions). Aspergillus tubingensis MUT 990 was selected as a suitable fungal strain. Literature research and previous experiences were used to design and build lab-scale (4 litres volume) and pilot-scale (1.5 m3 volume) reactors. The selected fungal strain was immobilised in polyurethane foam cubes carriers and inoculated in a novel rotating, submerged, packed bed reactor. The first test in bioreactors was carried out to evaluate the effect of rotation and the co-substrate addition on tannin removal. The second test in bioreactors was carried out in two submerged packed bed reactors run in parallel, the first one was fed with a condensed tannin (Quebracho tannin), and the second with hydrolysable tannin (Tara tannin), both were inoculated with Aspergillus tubingensis in attached form. The hydraulic retention time and the concentration of tannins in the medium were varied to maximise the removal capacity and to analyse the substrate inhibition. A stable biofilm was maintained in the first reactor during the 180 days of operation. On the other hand, in the second reactor there was a biomass detachment during the start-up and then grown as a suspended culture throughout the operational period (226 days). Soluble chemical oxygen demand removal up to 53% and 90% were achieved in the first and second bioreactor, respectively, without the addition of co-substrates. The microbial communities of the reactors, made up of fungi and bacteria, were characterised with a metagenomic analysis. In addition, an innovative technique, the heterogeneous respirometry, was applied to assess the biological activity of immobilised cells (biofilm). The data obtained were used to develop a mathematical model and to perform a kinetic and stoichiometric characterisation of the biomass. Since fungal biomass is poorly characterised with modelling and respirometry, dedicated experiments were set-up along with a respirometric procedure. The lab-scale results were used to design a pilot-scale reactor. Finally, after a start-up phase the pilot-scale reactor was fed with real tannin-rich wastewater collected from tanneries. At the end of the experimentation the biofilm was stable and an encouraging performance had been achieved. We believe the results obtained represent the first step for a future real-scale application to reach an efficient biological removal of tannins from tannery wastewater.