Descripción de un nuevo tipo de vesícula de membrana externa en bacterias gramnegativas: implicaciones en el contenido de DNA y RNA

Abstract

En la presente Tesis Doctoral se presenta la descripción y caracterización de un nuevo tipo de vesícula de membrana externa (MV) en bacterias gramnegativas, hallada tanto en cepas ambientales como en cepas patógenas. Para la caracterización de estas nuevas MVs se han utilizado técnicas de Criomicroscopía (Cryo-EM) y Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) de cortes ultrafinos de muestras preparadas mediante criofijación y criosubstitución (HPF-FS). La descripción del nuevo tipo de MVs ha aportado un nuevo modelo de vesiculación que sucede a través de la protuberancia conjunta de la membrana externa e interna, incorporando contenido del citoplasma. Éstas nuevas vesículas han sido nombradas como Vesículas de Membrana Externa e Interna (Outer-inner membrane vesicle, O-IMV). El inmunomarcaje de cortes ultrafinos de vesículas con un anticuerpo específico contra DNA, ha permitido confirmar que el DNA detectado contenido en muestras de MVs, es exportado en el interior de las nuevas O-IMVs. Las técnicas de TEM de cortes ultrafinos después de HPF-FS y Cryo-EM han sido esenciales para caracterizar el nuevo tipo de MVs. Asimismo, también han sido útiles para la caracterización de una cepa mutante hipervesiculante por delección de un componente estructural de la envuelta bacteriana, demostrando que los incrementos de MVs detectados como proteína o LPS, son causados por la presencia de artefactos vesiculares cuya funcionalidad se encuentra alterada respecto a las vesículas de la cepa salvaje. La descripción de las O-IMV ha permitido explicar cómo contenido del citoplasma es incorporado en vesículas. Este descubrimiento ha abierto la puerta a estudiar el contenido de RNA asociado a MVs de Pseudomonas aeruginosa PAO1. Se ha demostrando que el RNA en vesículas presenta unos tamaños comprendidos entre 40 ̶ 80 nucleótidos y contienen una proporción mucho menor de RNA ribosomal en comparación con la célula. La transcriptómica realizada comparando el contenido de RNA de muestras de MVs y células, ha confirmado que las MVs presentan un perfil de RNA distinto al celular, empaquetando mayoritariamente tRNAs. Además, se ha demostrado que el RNA internalizado en MVs es estable. Por otra parte, el estudio de la vesiculación asociada al crecimiento de Pseudomonas aeruginosa PAO1, ha determinado que la vesiculación no es constante y va estrechamente ligada a la

fisiología de la bacteria, detectando una mayor secreción de MVs con RNA al final de la fase exponencial, para posteriormente desaparecer. Todos estos resultados, indicarían que la presencia de RNA en MVs no es aleatoria sino debida a un mecanismo molecular de encapsulación. Se requerirán más estudios para poder determinar qué función biológica puede realizar el RNA secretado en MVs de Pseudomonas aeruginosa PAO1.

A structural study performed by transmission electron microscopy (TEM) after high- pressure freezing followed by freeze substitution (HPF-FS) of bacterial samples and Cryo-TEM, have revealed that Gram-negative bacteria naturally releases a more complex type of vesicle, termed Outer–Inner Membrane Vesicle (O-IMVs). Its formation is characterized by the protrusion of both outer and inner membranes, dragging along cytoplasmic component into vesicles. The presence of DNA inside this new type of vesicle was confirmed by gold DNA immunolabeling with a specific monoclonal IgM against double-stranded DNA. The production of these O-IMVs explains the presence of components from cytoplasm in membrane vesicles (MVs) and opens up new areas of study their functionality. Recently, small RNA (sRNAs) have emerged as crucial regulators in bacterial physiology. Several studies have reported the presence of sRNAs inside vesicles, but their role is still unknown. To characterize the RNA content in MVs from Pseudomonas aeruginosa PAOA1 a transcriptomic analysis from RNA obtained from vesicles and cells was conducted. The study reveals that MVs are enriched in RNAs ranging from 40 to 80 nt, which corresponds mainly to tRNAs. Moreover, the RNA-seq from vesicles obtained at different points of PAO1 growth curve was performed, showing that that vesicles containing RNA are produced before starting the transition from exponential to stationary growth phase. Our findings suggest that sRNAs are selectively packaged into MVs and actively secreted. Finally, a structural study was performed to characterize a tolR mutant derived from the probiotic strain Escherichia coli Nissle to confirm the “hypervesiculating” phenotype. TEM observation after HPF-FS of bacterial samples, together with cryo-TEM observation of plunge-frozen hydrated isolated MVs showed considerable structural heterogeneity in the EcN tolR samples. Moreover, experiments of MV uptake in Caco-2 cells using rhodamine evidenced that EcN tolR MVs displayed reduced internalization levels compared to the EcN wild-type MVs. These findings indicate that heterogenicity of MVs from EcN tolR mutants may have a major impact on vesicle functionality.