Analysis of the genetic basis of porcine meat quality and coat color by using genomic and transcriptomic tools

Abstract

Los principales objetivos de esta Tesis fueron investigar la base genética de la composición y deposito de la grasa en cerdos, e identificar los factores genéticos involucrados en el establecimiento de los patrones de pigmentación rubia vs roja en cerdos Mangalitza, mediante el uso de herramientas genómicas y transcriptómicas. En el primer estudio comparamos los patrones de expresión del músculo esquelético en dos grupos de cerdos Duroc, con diferentes perfiles de crecimiento y engrasamiento (HIGH: elevado espesor del tocino dorsal, grasa intramuscular, contenido de ácidos grasos saturados e insaturados y lípidos séricos vs LOW: fenotipos opuestos). Mediante el uso de la técnica RNA-seq, hemos encontrado que 96 genes se expresan diferencialmente en el músculo gluteus medius de cerdos HIGH y LOW. Varios de estos genes están relacionados con el metabolismo lipídico (p.ej, SLC27A4, SFRP5, y CES1) y el factor de transcripción PPARG parece ser un regulador clave del engrasamiento en porcino. También hemos observado que muy pocos RNAs no codificantes se expresan diferencialmente en estos dos grupos de cerdos, lo que sugiere que el transcriptoma no codificante tiene un efecto limitado sobre el establecimiento de los fenotipos HIGH y LOW. En el segundo estudio, analizamos la expresión de isoformas de mRNA en cerdos HIGH y LOW y demostramos la expresión diferencial de isoformas específicas de cuatro genes muy relacionados con la obesidad (ITGA5, LITAF, TIMP1 y ANXA2). La expresión diferencial de estas isoformas podría tener efectos sobre la estructura del transcrito, así como sobre la secuencia de la proteína. En el tercer estudio, hemos analizado la expresión diferencial de genes que codifican mRNA en respuesta a la ingestión de alimentos. Este objetivo se ha logrado al comparar los patrones de expresión muscular de cerdas Duroc antes de comer (T0), 5 h. (T1) y 7 h. (T2) después de comer. Además de los genes con un papel bien conocido en la homeostasis energética (p.ej, PFKFB3 y G0S2), hemos identificado varios genes con un rol plausible pero mal caracterizado en el metabolismo (p.ej, MIGA2, SDC4 y CSRNP1). También hemos observado un enriquecimiento de un conjunto de genes expresados ​​diferencialmente antes y después de comer que engloba diversos factores de transcripción así como genes implicados en el estrés oxidativo, la angiogénesis y los ritmos circadianos. Teniendo en cuenta estos resultados, en el cuarto estudio hemos desarrollado un experimento basado en RT-qPCR para descubrir cómo la expresión de 8 genes circadianos (ARNTL, BHLHE40, CRY2, NPAS2, NR1D1, PER1, PER2 y SIK1) se modifica en respuesta a la ingestión de alimentos en cinco tejidos porcinos (músculo esquelético, hipotálamo, hígado, intestino y grasa dorsal). Nuestros resultados indican que la expresión de los genes circadianos no cambia en el hipotálamo, el tejido que contiene el reloj central influenciado por la luz. Por el contrario, dicha expresión sí que presenta fuertes variaciones en los otros cuatro tejidos. Este hallazgo demuestra que la nutrición cambia la expresión de los genes circadianos integrados en los relojes periféricos. Finalmente, en el quinto estudio, hemos analizado, en colaboración con investigadores del Research Institute for Animal Breeding and Nutrition (Hungría) y la Universidad de Cluj-Napoca (Rumanía), la base genética del color de la capa (rojo vs rubio) en cerdos Mangalitza. Combinando un barrido de selección y un estudio de asociación del genoma completo, hemos encontrado que el gen SLC45A2 probablemente esté involucrado en la determinación genética de la pigmentación roja y rubia de los cerdos Mangalitza, un resultado que concuerda bien con estudios previos que demuestran la implicación de este locus en los patrones de color de múltiples especies de mamíferos, incluyendo la especie humana. Más específicamente, dos SNP con efecto no-sinónimo, c.806G>A (p.Gly269Glu) y c.956G>A (p.Arg319His), situados en el gen SLC45A2, están fuertemente asociados con los colores rojo y rubio, no obstante dicha asociación no es completa por lo que cabe deducir la existencia de factores genéticos adicionales en la pigmentación de los cerdos Mangalitza.

The main objectives of this Thesis were to investigate the genetic basis of fatness in pigs and to identify the genetic factors involved in the establishment of blond vs red pigmentation patterns in Mangalitza pigs by using genomic and transcriptomic tools. In the first study of the Thesis (Chapter 3), we compare the skeletal muscle expression patterns of two groups of Duroc pigs with different growth and fatness profiles (HIGH: high backfat thickness, intramuscular fat, saturated and unsaturated fatty acid content and serum lipids vs LOW: opposite phenotypes). By using a RNA-Seq technology, we identified 96 genes differentially expressed. Several of these genes are related to lipid metabolism (e.g. SLC27A4, SFRP5 and CES1) and the transcription factor PPARG appears to be a key regulator of porcine fatness. We have also observed that very few non-coding RNAs are differentially expressed in these two groups of pigs, suggesting that the non-coding transcriptome has a limited effect on the establishment of the HIGH and LOW phenotypes. In the second study of the Thesis, we demonstrate the differential expression of specific mRNA isoforms of four genes with a known role in obesity (ITGA5, LITAF, TIMP1 and ANXA2) in HIGH vs LOW pigs. The differential expression of these isoforms may have effects on transcript structure as well as on the protein sequence. In the third study, we aimed to investigate the differential expression of mRNA encoding genes in response to food ingestion. This goal has been achieved by comparing the muscle mRNA expression patterns of Duroc sows before feeding (T0) and 5 h. (T1) and 7 h. (T2) after feeding. Besides genes with a well-known role in energy homeostasis (e.g. PFKFB3 and G0S2), we have identified several genes with a plausible but poorly characterized role in metabolism (e.g. MIGA2, SDC4, and CSRNP1). We have also observed that the set of genes differentially expressed before and after feeding is enriched in transcription factors and pathways related to oxidative stress, angiogenesis, and circadian rhythms. Considering these results, in the fourth study we use quantitative RT-qPCR technique to find out how the expression of 8 circadian genes (ARNTL, BHLHE40, CRY2, NPAS2, NR1D1, PER1, PER2 and SIK1) changes in response to food ingestion in five porcine tissues i.e. skeletal muscle, hypothalamus, liver, intestine and dorsal fat. Our results indicate that the expression of the Clock genes does not change in the hypothalamus, the tissue containing the central clock entrained by light, but in contrast, it is strongly modified in the other four tissues. This finding demonstrates that nutrition changes the expression of circadian genes integrated in peripheral clocks. Finally, in the fifth study, we have analysed, in collaboration with researchers of the Research Institute for Animal Breeding and Nutrition (Hungary) and the University of Cluj-Napoca (Romania), the genetic basis of coat color (red vs blond) of Mangalitza pigs. By combining a selection scan and a genome-wide association study, we have found that the SLC45A2 gene is probably involved in the genetic determination of pigmentation in Mangalitza pigs, a result that agrees well with previous studies demonstrating the implication of this locus on the color patterns of multiple mammalian species including humans. More specifically, two missense SNPs c.806G>A (p.Gly269Glu) and c.956G>A (p.Arg319His) in the SLC45A2 locus appear to be strongly but not fully associated with the red and blond coat colors of Mangalitza pigs. This finding suggests the existence of addiitonal genetic factors regulating the pigmentation of Mangalitza pigs.