RANK signaling in mammary spontaneous tumorigenesis and tumor-stromal crosstalk

Abstract

The discovery that RANK signaling mediates the protumorigenic role of progesterone in the mammary gland and its association with poor prognosis in breast cancer has opened the possibility of using RANKL inhibitors for breast cancer prevention but its therapeutic potential remained unexplored. Moreover, RANK expression is enriched in hormone receptor negative adenocarcinomas suggesting additional roles for RANK signaling beyond its hormone- dependent function. This work is mainly focused on exploring the role of RANK signaling on established mammary tumors, which could justify its potential use for breast cancer treatment. With this aim, we have used the mouse mammary tumor virus- Polyoma Middle T (MMTV- PyMT) which mimics RANK and RANKL expression patterns seen in human breast adenocarcinomas. Complementary genetic and pharmacological approaches demonstrate that RANK signaling promotes tumor progression, recurrence and survival of tumor cells by tumor cell intrinsic and tumor cell extrinsic mechanisms. Regarding to the tumor cell intrinsic mechanisms, therapeutic inhibition of RANK signaling drastically reduces the cancer stem cell pool, delays latency, decreases tumor and metastasis initiation and enhances sensitivity to chemotherapy. Mechanistically, genome wide expression analyses showed that anti-RANKL therapy promotes lactogenic differentiation of tumor cells. We further show that RANK signaling in tumor cells negatively regulates Ap2 transcription factors, and enhances the Wnt agonist Rspo1 and the Sca1- population, enriched in tumor initiating cells. Additionally, we found that expression of TFAP2B and the RANK inhibitor, OPG, in human breast cancer correlate and are associated with better relapse free survival. Regarding to the tumor cell extrinsic mechanisms, we found that RANK loss exclusively in tumor cells, drastically changes the tumor infiltrating lymphocytes (TIL)’s landscape. An increase in tumor infiltrating leukocytes and cytotoxic CD8 T lymphocytes, a lower CD4/CD8 ratio and a reduction in the immunosuppressive Ly6G neutrophils, hallmarks associated to anti- tumor response and good outcome, are found in RANK-deficient tumors. Strikingly, a T-cell deficient environment rescues the delayed tumor latency and reduced tumor initiating ability observed upon transplantation of RANK null tumor cells in an immunocompetent environment. Moreover, depletion experiments reveal CD8+ cytotoxic T cells as partially responsible for the induction of RANK null tumor cell death. Importantly, RANKL pharmacological inhibition also results in an increase in the number of infiltrating CD8 T cells and a more active IFNγ response. Mechanistically, we found that RANK depletion in tumor cells leads to decreased survival enhancing antigen presentation which may result into a more efficient anti-tumor immune response. In addition, decreased expression of TGFβ in the tumors, together with the decreased neutrophil infiltration could strengthen further the cytotoxicity of CD8. Despite the initially active immune responses tumors lacking RANK finally evade immune surveillance by activating inhibitory checkpoints. Finally, when anti-RANKL was combined with anti- CTLA4/PD-L1 treatment a synergistic temporary-dependent effect decreasing tumor growth was observed. These results support the use of RANKL inhibitors to reduce recurrence and metastasis and to boost the immune response in breast cancer patients based on its ability to induce tumor cell differentiation and to potentiate the anti-tumor immune response.

El descubrimiento de que la vía de RANK media el papel protumoral de progesterona en la glándula mamaria y su asociación con un mal pronóstico en cáncer de mama ha abierto la posibilidad de usar inhibidores de RANKL como medida preventiva en cáncer de mama. Sin embargo, su posible uso como agente terapéutico no ha sido estudiado. Por ello, este trabajo se centra en estudiar la vía de RANK en tumores establecidos para explorar esta posibilidad. Para nuestro estudio, hemos empleado el modelo murino MMTV-PyMT, que presenta patrones de expresión de RANK y RANK similares a los encontrados en humano. Valiéndonos de métodos genéticos y farmacológicos hemos demostrado que la vía de RANK promueve progresión tumoral, recurrencia y supervivencia de las células tumorales a través de mecanismos intrínsecos y extrínsecos. En cuanto a los primeros, la inhibición terapéutica de la vía de RANK reduce el pool de cancer stem cells, incrementa la latencia tumoral, disminuye la iniciación de tumores y de metástasis e incrementa la sensibilidad a la quimioterapia. A nivel de mecanismo, el análisis de expresión génica muestra que la terapia anti-RANKL promueve la diferenciación de las células tumorales a un fenotipo lactogénico. Además, la vía de RANK en células tumorales regula de manera negativa los factores de transcripción Ap2 e incremente la expresión de Rspo1, agonista de la vía de Wnt, y de la población Sca1- enriquecida en células iniciadoras de tumores. En cuanto a los mecanismos extrínsecos, encontramos que la ausencia de RANK exclusivamente en células tumorales cambia de manera notable el escenario de los linfocitos que infiltran el tumor, de manera que se produce un incremento del total de leucocitos y de linfocitos T CD8 citotóxicos, mientras que se reduce el ratio CD4/CD8 y el número de los neutrófilos Ly6G+ inmunosupresores. Sin embargo, en ratones que carecen de linfocitos T, las diferencias de latencia y de habilidad de iniciación de tumores en tumores que se han desarrollado en un entorno inmunocompetente entre tumores con y sin RANK desaparecen. Además, experimentos de depleción revelan que los linfocitos T CD8 son parcialmente responsables de la inducción de muerte en las células tumorales que carecen de RANK. Paralelamente, la inhibición farmacológica de RANKL también incrementa el número de CD8 infiltrantes así como una respuesta IFNγ más activa. En cuanto al mecanismo, la depleción de RANK en células tumorales resulta en una menor supervivencia, lo que aumenta la presentación antigénica produciendo una respuesta antitumoral más eficiente. Finalmente, a pesar de la respuesta inmune más fuerte exhibida por los tumores que carecen de RANK, éstos acaban consiguiendo evadir su acción mediante la activación de checkpoint inhibitors. La combinación de anti-RANKL con anti-CTLA4/PD-L1 promueve una respuesta sinérgica cuyo efecto en la disminución del crecimiento tumoral es máximo en una ventana de tiempo concreta. Por todo ello, creemos que estos resultados apoyarían el uso de inhibidores de RANKL para reducir la recurrencia y la metástasis y para fortalecer la respuesta inmune en pacientes con cáncer de mama.