Fruit-like and rose-like aroma production via solid-state fermentation of sugarcane bagasse: process optimization and production strategies

Abstract

Aquesta tesi es centra en l'avaluació de la fermentació en estat sòlid (FES) de residus agroindustrials, com alternatiu per a la producció d'aromes de valor afegit. Dos grups de compostos han estat considerats com a objectius. Les aromes de fruita, inclosos alguns compostos volàtils com aldehids, cetones, alcohols i èsters. D'aquests, els èsters alifàtics són aquells amb més valor afegit donat el seu particular olor a fruites. El segon grup són els aromes de roses, constituïts pel 2-feniletil alcohol (2-FA) i el 2-feniletil èster (2-FE); compostos utilitzats com a additius gràcies al seu olor a roses. En tots dos casos, l'objectiu ha estat el desenvolupament de bioprocessos basats en l'ús de residus, emprant com el bagàs de canya i les melasses de remolatxa. Amb aquest objectiu, s'ha utilitzat el llevat Generalment Reconeguda com Segur Kluyveromyces marxianus. La bioproducció de les aromes de fruita s'exposen a la primera secció. Aquesta inclou la selecció del substrat, així com l'avaluació preliminar d'algunes de les variables que afecten al procés. Un cop seleccionat el substrat, la producció d'aquests compostos ha estat avaluada a escala laboratori en bioreactors de 0.5L operats en discontinu. D'aquest apartat es pot indicar que el procés es veu significativament afectat per la temperatura i el cabal d'aire. Es va trobar que la màxima producció de volàtils (incloses totes les espècies quantificades) va ser de 161 mgVol per gram de substrat inicial en base seca (gST), a 40°C, 0.14 Lh-1g-1ST i addicionant un 35% de melasses. D'altra banda, la màxima producció d'èsters va ser obtinguda a 30°C, 0.11 Lh-1g-1ST i addicionant un 25% de melasses, aconseguint-se 47 mgEstg-1ST. Finalment, partint de l'optimització del procés a escala laboratori, el procés va ser avaluat a escales superiors (4.5 i 22L). En aquest cas, l’estudi s'ha enfocat en l'efecte que tenen les estratègies d'operació sobre l'acompliment global del procés. Així, la FES en discontinu s'ha comparat amb el procés emprant barrejat intermitent i operant en fed-batch. Aquesta última estratègia ha resultat ser una eina que afecta positivament la selectivitat cap als èsters, millorant al mateix temps alguns dels índexs de rendiment que descriuen el procés. La bioproducció d'aromes de rosa per FES és el objectiu de la segona secció. Inicialment s’ha fet l'avaluació de la FES en condicions estèrils en bioreactors de 0.5L. En aquest cas, es va desenvolupar un estudi inicial sobre les variables d'operació que afecten el procés, així com de diverses estratègies per millorar la producció. Es va trobar que la producció de 2-FA i 2-FE està associada amb l'activitat microbiològica del K. marxianus, i per tant, allargar aquesta activitat resulta en un factor decisiu per millorar la producció. En aquest sentit, l'addició de fonts addicionals de carboni, o l'ús de fed-batch han resultat ser alternatives eficients per millorar la producció de 2-FA i 2-FE. Partint dels resultats a escala laboratori, el procés va ser estudiat a escales més grans (1.6 i 22L) retirant algunes de les limitacions associades als processos a aquesta escala, com el control de temperatura i l'esterilització dels substrats. L'anàlisi d'aquesta part s’ha enfocat a l'ús d'estratègies d'operació com a eines per millorar l'acompliment global del procés. Així, la fermentació en discontinu ha estat contrastada amb la FES per fed-batch i la discontinua seqüencial. En aquest cas, la producció assolida en el procés en discontinu (17 mg2-FA+2-FE per gram de substrat inicial sec) va ser millorada a l'implementar les estratègies alternatives, aconseguint-se 19.2 mg2-FA+2-FEg-1ST al cas del fed-batch. De manera global, els resultats presentats constitueixen un pas endavant en el desenvolupament de la FES com a alternativa per produir aromes com a compostos de valor afegit a partir de residus agroindustrials.

Esta tesis se centra en la evaluación de la fermentación en estado sólido (FES) de residuos agroindustriales, como alternativa para la producción de aromas de valor añadido. Dos grupos de compuestos se consideraron como objetivos a estudiar. Los aromas frutales, que incluyen algunos compuestos volátiles como aldehídos, cetonas, alcoholes y ésteres. De estos, los ésteres alifáticos se consideran los de mayor valor añadido dado el olor a frutas que proveen. El segundo, los denominados aromas de rosas, conformados por el 2-feniletil alcohol (2-FA) y el 2-feniletil éster (2-FE); compuestos empleados como aditivos dado el olor a rosas que proveen. En ambos casos, el objetivo fue el desarrollo de bioprocesos basados en el uso de residuos, empleando como materias primas el bagazo de caña y las melazas de remolacha. Con este objetivo, se utilizó la levadura Generalmente Reconocida como Segura Kluyveromyces marxianus. La bioproducción de los aromas frutales se expone en la primera sección. Esta incluye la selección del sustrato, así como la evaluación preliminar de algunas de las variables que afectan al proceso. Una vez seleccionado el sustrato, la producción de estos compuestos ha sido evaluada a escala laboratorio en bioreactores de 0.5L operados por lotes. De allí se concluye que el proceso es significativamente afectado por la temperatura y el caudal de aire. Se encontró que la máxima producción de volátiles (incluidas todas las especies cuantificadas) fue de 161 mgVol por cada gramo de sustrato inicial en base seca (gST), a 40°C, 0.14 Lh-1g-1ST y adicionando un 35% de melazas. También, la máxima producción de ésteres fue alcanzada a 30°C, 0.11 Lh-1g-1ST y 25% de melazas, con 47 mgEstg-1ST. Finalmente, partiendo de la optimización del proceso por lotes, el proceso fue evaluado en escalas superiores (4.5 y 22L). Allí, la evaluación se enfocó en el efecto que tienen las estrategias de operación sobre el desempeño global del proceso. Así, la FES por lotes se comparó ante el proceso con mezclado intermitente y operando por lotes alimentados. Esta última estrategia resultó ser una herramienta que afecta positivamente la selectividad hacia los ésteres, mejorando además los índices de desempeño que describen el proceso. La bioproducción de aromas de rosa es el objetivo de la segunda sección. Inicialmente se aprecia la evaluación de la FES en bioreactores de 0.5L. Allí, se realizó un barrido inicial sobre las variables de operación que afectan el proceso, así como de algunas estrategias para mejorar la producción. Se encontró que la producción de 2-FA y 2-FE está asociada con la actividad microbiológica del K. marxianus, con lo cual extenderla es un factor que resulta decisivo para mejorar la producción. La adición de fuentes adicionales de carbono, o el uso de una alimentación fraccionada resultaron ser eficientes para mejorar la producción. Partiendo de los resultados a escala laboratorio, el proceso fue valorado a escalas mayores (1.6 y 22L) eliminando algunas de las limitaciones asociadas al trabajo a dicha escala como el control de temperatura y la esterilización de los sustratos. El análisis de esta parte se enfocó en el uso de estrategias de operación como herramientas para mejorar el desempeño global del proceso. Allí, la fermentación por lotes se contrastó ante la FES por lotes alimentados y empleando lotes secuenciales. Así, la producción alcanzada en el proceso por lotes de 17 mg2-FA+2-FE por gramo de sustrato inicial seco fue mejorada al implementar dichas estrategias, alcanzando 19.2 mg2-FA+2-FEg-1ST en el caso de lotes alimentados y 21 mg2-FA+2-FEg-1ST en los lotes secuenciales. De modo global, los resultados presentados constituyen un paso adelante en el desarrollo de la FES como alternativa para producir estos compuestos de valor añadido a partir de residuos agroindustriales.

This thesis focuses on the use of solid-state fermentation (SSF) as an alternative approach to the bioproduction of value-added aroma compounds through the valorization of selected agro-industrial residues. Specifically, two groups of objective aroma compounds have been studied. First, the fruit-like compounds, among which could be included a set of volatile scented species such as aldehydes, ketones, alcohols and esters. From these, the straight-chain esters could be catalogued as those more appreciated due to their high fruit-like aroma profile. The second group of species studied here are the semi-volatile compounds known as rose-like compounds, which are constituted by 2-phenethyl alcohol (2-PE) and 2-phenethyl acetate (2-PEA), two value-added species widely used as additives due to the rose-like odor they provide. In both cases, the aim was to develop residue-based bioprocesses using as raw materials the agro-industrial residue sugarcane bagasse (SCB) and the industry by-product sugar beet molasses (SBM). With this aim, the Generally Recognized As Safe (GRAS) yeast Kluyveromyces marxianus was used in the study. Developments related to the bioproduction of fruit-like compounds are exposed in the first section of the thesis. They include the initial substrate screening and an initial assessment of the operational variables affecting the process. Then, the optimization of the fruit-like compounds production in a batch SSF at 0.5 L system is developed. In that sense, it was found that the bioproduction is significantly affected by operational variables like the temperature and the air flow rate. While the maximum volatile production (including all the quantified species) was 161 mgVol per gram of dry substrate (g-1TS) at 40°C, 0.14 L h-1 g-1TS and 35% SBM, the ester species were maximized at 30°C, 0.11 L h-1 g-1TS and 25% SBM up to 47 mgEst g-1TS. Finally, based on the optimization of the batch SSF at lab scale, the evaluation of the process at bench-scale was performed (4.5 and 22 L scales). In this case, the analysis has been focused on the effects of some operational strategies named intermittent mixing and fed-batch SSF in the global performance of the bioprocess. Fed-batch has shown interesting characteristics affecting the selectivity of the ester species and also improving some of the evaluated performance indices. Bioproduction of the rose-like compounds via SSF is the core of the second section of this thesis. In this case, the first part is devoted to the evaluation of the feasibility of the process under sterile conditions in a batch SSF 0.5 L system. It was found that extending the K. marxianus activity is a key factor to increase the 2-PE and 2-PEA production. In this sense, by adding supplementary carbon sources to the media or splitting the substrate load (as a manner of a fed-batch mode) resulted in efficient and consistent ways to promote the biotransformation of these compounds. Based on the results at 0.5 L, the process was further evaluated at bench-scale (1.6 and 22 L scales) by releasing some of the constraints found at lab-scale such as the temperature control and the sterilization of the substrates. Again, the analysis was focused on the assessment of the operational strategies fed-batch and sequential-batch as alternative approaches to enhance the global behavior of the process. Here, strategies have succeeded increasing the 2-PE and 2-PEA production from 17 mg2-PE+2-PEA per gram of dry substrate (g-1TS) in a batch scenario, up to 19.2 mg2-PE+2-PEA g-1TS by using a fed-batch approach, and until 21 mg2-PE+2-PEA g-1TS through a sequential-batch. Overall, the results exposed in this thesis represent a step forward in the development of SSF as an alternative approach for producing valuable aroma compounds from agro-industrial wastes.