Fenotips de resistència a antibiòtics en Stenotrophomonas maltophilia: Impacte en la susceptibilitat a la colistina

Abstract

Stenotrophomonas maltophilia és un patogen oportunista de rellevància creixent a causa de la seva ascendent prevalença com a nosocomial. Tot i que es tracta d’un microorganisme ambiental amb una virulència limitada, S. maltophilia presenta resistència intrínseca a múltiples antibiòtics i pot produir múltiples infeccions, especialment en pacients immunocompromesos o amb fibrosi quística. Aquest treball de tesi s’engloba dins d’un projecte enfocat a la recerca i estudi de determinants de virulència i resistència a S. maltophilia, i el seu objectiu general és l’estudi de fenotips de resistència, en particular front colistina. La colistina és un antibiòtic polipeptídic que s'està utilitzant cada vegada més com a opció alternativa o "d'últim recurs" per tractar infeccions causades per organismes gramnegatius multiresistents. La primera part del treball confirma l'heterogeneïtat fenotípica i genotípica de S. maltophilia en una col·lecció de 78 aïllats clínics europeus. Els genotips s'han determinat mitjançant l’estudi del perfil MLST i el gen rpfF. També s’ha avaluat la susceptibilitat antimicrobiana, la formació de biofilms i la virulència. De manera general, no existeix associació entre les variables genotípiques i els fenotips de resistència i virulència avaluats, tot i que hi ha un grup genòmic, àmpliament distribuït geogràficament, que destaca per la seva capacitat de formar biofilm i la seva virulència. També, s’ha demostrat que les soques amb variant rpfF-2 són més formadores de biofilm que les rpfF-1. S’ha confirmat que els antibiòtics més eficaços contra S. maltophilia són el trimetroprim-sulfamethoxazol i la minociclina, malgrat hi hagi un 68,8% de soques multiresistents (MDR) i detectar-se una gran heterogeneïtat en la resistència a la colistina dins de cada soca. A la segona part, s’han estudiat les possibles causes de la resistència heterogènia a la colistina. Per avaluar la resistència adaptativa i l’heteroresistència, els aïllats van ser sotmesos a assajos Etest consecutius, a anàlisis de taxes de creixement i a assajos PAP (Perfil d’anàlisi poblacional). Els resultats han revelat que la majoria (78,7%) dels aïllats presenten una varietat de mecanismes de resistència poblacional diferents, incloent resistència adaptativa i heteroresistència. Curiosament, el desenvolupament de la subpoblació resistent ha estat reversible. Aquest fenotip complex de resistència a colistina, que hem anomenat “heteroresistència adaptativa”, es presenta de manera diferent entre els aïllats i afecta significativament les proves recomanades de susceptibilitat a la colistina. Finalment, s’han descrit els possibles determinants genètics que participen en els fenotips de resistència a la colistina. Específicament, s'han validat experimentalment els homòlegs cromosòmics dels gens mcr d’E. coli (smlt2804 i smlt3571), i els que codifiquen per a la bomba d’expulsió SmeGH (smlt3170-3171) i un component del sistema regulador ParRS. Mitjançant mutants de la soca K279a, s’ha demostrat que smlt3571 està directament implicat en la resistència a la colistina ja que la soca deficient per aquest gen és més susceptible. D'altra banda, smlt2804 probablement té un paper important en la resistència adaptativa a colistina també mitjançant modificació del lipopolisacàrid (LPS). Així mateix, s’ha demostrat que ParRS contribueix a la resistència adaptativa a colistina però depenent de la concentració de Mg2+. La bomba d’expulsió SmeGH no s’ha associat a la resistència a la colistina, però s’ha determinat que l'eliminació de SmeGH redueix la formació de biofilms induïda per antibiòtics. Tenint present tot el que s’ha exposat, S. maltophilia té la capacitat d’adaptar-se i esdevenir més resistent a la colistina mitjançant una combinació de mecanismes reguladors que podrien provocar la modificació del LPS. Aquests mecanismes, a més a més, varien tant a nivell poblacional dins d’una mateixa soca com entre les diferents soques circulants. Per aquests motius, doncs, la colistina no hauria de ser considerada com una opció terapèutica rutinària contra aquest bacteri. Malgrat això, no s’ha de descartar com fàrmac d’últim recurs i, consegüentment, són necessaris més estudis sobre els mecanismes de resistència a aquest fàrmac, així com també, estudis per al disseny de noves estratègies antimicrobianes.

Stenotrophomonas maltophilia is an opportunistic pathogen of growing relevance due to its increasing prevalence in the nosocomial settings. Albeit an enviromental microorganism with limited virulence, S. maltophilia shows intrinsic resistance to multiple antibiotics and can produce a broad spectrum of clinical infections, especially in immunocompromised patients or people with cystic fibrosis. This thesis is a part of a project dealing with the search and study of virulence and resistance determinants in S. maltophilia, and its main objective is to study resistance phenotypes, particularly to colistin. Colistin is a polypeptide antibiotic that is being used increasingly as alternative or “last-resort” option to treat infections by multiresistant Gram-negative bacteria. In the first part of this work, the phenotypic and genotypic heterogeneity of S. maltophilia is confirmed in a collection of 78 european clinical isolates. Genotypes were determined by analyzing MLST profiles and sequences of the rpfF gene. Antimicrobial susceptibility, biofilm formation and virulence were also determined in all isolates. In general, no associations between genotypic and phenotypic variables were found, although there was a genomic group, widely distributed geographically, which stood out due to the ability to form biofilm and the virulence of its members. In addition, rpfF-2 strains were more biofilm producer than rpfF-1.It was confirmed that the most effective antibiotics against S. maltophilia are trimethroprim-sulfamethoxazole and minocycline, despite most of isolates (68.8%) were considered MDR and to identify heterogeneous resistance phenotypes to colistin. In the second part, we investigated that heterogeneous resistance to colistin. To evaluate adaptive resistance and heteroresistance, the isolates were subjected to serial Etest assays, growth rate analyses, and the population analysis profile test. Our studies revealed that most of our S. maltophilia isolates (78.7%) display different populational resistance mechanisms including adaptative resistance and heteroresistance. Interestingly, the development of the resistant subpopulation was reversible. This complex colistin-resistance phenotype, we have termed adaptive hetero-resistance, was displayed differently by the isolates and significantly affected to recommended colistin susceptibility testing. Finally, in the last part of this work, possible genetic determinants for colistin resistance were described. Among them we validated two chromosomal homologs of the E. coli mcr genes (smlt2804 and smlt3571), and those encoding for the SmeGH efflux pump (smlt3170-3171) and a component of the ParRS regulatory system. By site-specific mutagenesis in the K279a strain, we have shown that smlt3571 is directly involved in colistin resistance since a strain defective in this enzyme is more susceptible to this antibiotic. On the other hand, smlt2804 probably plays an important role in adaptive resistance to colistin also by modification of lipopolysaccharide (LPS). Moreover, we demonstrated that ParRS contributed to adaptive resistance to colistin, but in this case in response to the extracellular concentration of Mg2+. The SmeGH efflux pump was not associated to colistin resistance, but we demonstrated that deletion of the smeGH operon reduce antibiotic-induced biofilm formation. Taking all together, we have shown that S. maltophilia has the ability to adapt and to become more resistant to colistin by a combination of regulatory mechanisms that could cause, ultimately, modifications in the LPS. Moreover, these mechanisms vary both at a population level within the same strain and between different circulating strains. For these reasons, colistin should not be considered as a routine therapeutic option against this bacterium. However, it should not be ruled out as a last-resort drug and, consequently, further studies about the mechanisms of colistin resistance are needed, as well as for the design of novel antimicrobial strategies.