Analysis of the molecular function of kazrin in endosomal trafficking

Abstract

Endocytosis and endosomal trafficking are of central meaning in all eukaryotic cells. It enables cells to rapidly modify their surface exposure of signalling complexes, nutrient and ion transporters, to maintain the homeostasis of lipids and proteins, to distribute internalized material within the cell, and to initiate and maintain cell motility, among others. Hence, the endocytic uptake and transport processes can regulate the capacity of the cell to sample and react to with their environment.

This thesis focused on the study of kazrin C, a human protein originally identified in our group, whose overexpression interferes with clathrin-mediated endocytosis (CME), one of the best studied endocytic pathways. Preliminary experiments demonstrated that kazrin C interacts with the clathrin- associated machinery from rat brain extracts. Further, that data indicated that depletion of kazrin accelerates CME and recycling of the widely used endocytic marker transferrin (Tfn), whereas it impairs arrival of internalized Tfn to the perinuclear endosomal recycling compartment (ERC). Last, initial experiments suggested that kazrin might localized to sorting endosomes (SE), together with rab4, γ-adaptin and EHD3.

The work presented here confirmed the previously observed effects in Tfn uptake and endocytic trafficking upon kazrin depletion. Further, subcellular fractionation experiments biochemically reinforced the view that a fraction of kazrin is localized to endosomal compartments. Consistently also, transfected GFP-kazrin could be seen forming subdomains on YFP-rab4 positive endosomes in living cells. Further, we provide biochemical evidence indicating that kazrin C directly interacts with clathrin and the clathrin adaptor AP-1, which together with rab4b, have been implicated in the transport between the sorting and recycling endosomes, similar to kazrin. Finally, we found that kazrin co-localize with endosomal actin and that it directly interacts with the Arp2/3 complex and WASH, the main the activator of the Arp2/3 complex on endosomal membranes. Both, depletion and overexpression of kazrin resulted in accumulation of endosomal actin. The data suggest that kazrin might inhibit cytosolic WASH, but upon activation, it might induce WASH-dependent actin polymerization on AP-1 and clathrin-enriched endosomal subdomains, promoting the formation or fission of transport intermediates between the sorting and recycling compartments.

Altogether, the results indicated a role for kazrin at the sorting endosomal recycling trafficking crossroad, favouring transport towards the ERC together with clathrin and AP-1, versus the short loop recycling path to the plasma membrane. At the molecular level, the data suggest kazrin might control the balance of WASH-induced actin polymerization on either retromer or clathrin-enriched endosomal subdomains.

La endocitosis es esencial para la célula eucariota. Permite a las células modificar rápidamente los complejos implicados en señalización y los transportadores de nutrientes e iones expuestos en la superficie celular, y es además esencial para mantener la homeostasis de proteínas de membrana y de lípidos y para distribuir el material intracelular. Por tanto, el tráfico endocítico puede regular la capacidad de la célula para detectar cambios en su microambiente y reaccionar ante ellos.

Esta Tesis se centra en el estudio de la kazrina C, una proteína humana originalmente identificada en un cribado genético destinado a aislar cDNAs cuya sobreexpresión inhibía la endocitosis dependiente de clatrina (EMC), una de las vías de internalización endocítica mejor caracterizadas. Experimentos preliminares demostraron que la kazrina C era capaz de interaccionar con la maquinaria endocítica asociada a clatrina y que la depleción de la kazrina aceleraba la EMC y el reciclaje de la transferrina (Tfn), impidiendo sin embargo su transporte a los endosomas de reciclaje localizados perinuclearmente. Por otro lado experimentos basados en la immunofluorescencia indicaron que la kazrina C se localizaba en los endosomas tempranos donde se clasifica el material para su reciclado o degradación (Endosomas de clasificación), junto con la GTPasa rab4, la subunidad γ-adaptina del adaptador de clatrina AP-1 y EHD3.

El trabajo aquí presentado confirma los efectos de la depleción de la kazrina sobre el tráfico de de la Tfn, utilizando una aproximación diferente para minimizar su expresión celular y ratifica mediante fraccionamiento subcelular el reclutamiento de la kazrina en endosomas tempranos. En consistencia con estas observaciones, demostramos también que en células transfectadas de manera transitoria, GFP-kazrina forma microdominios sobre endosomas marcados con YFP-rab4 en células vivas. Además, este trabajo aporta evidencias sólidas que demuestran una interacción directa de la Kazrina C con el dominio N-terminal de la clatrina y con su adaptador AP-1, que junto con Rab4b, y al igual que la kazrina, son necesarios para el transporte entre los endosomas de clasificación y los de reciclaje. Finalmente demostramos en este trabajo que la kazrina colocaliza con la actina endosomal y que interacciona directamente con el complejo Arp2/3 y su activador endosomal WASH y que tanto la depleción como la sobreexpresión de kazrina aumentan considerablemente la cantidad de actina polimerizada sobre estos orgánulos. Los datos son coherentes con un modelo según el cual la kazrina actuaría como un inhibidor citosólico de WASH, que sin embargo, una vez activado en las membranas endosomales podría inducir la polimerización de actina dependiente de WASH y del complejo Arp2/3 sobre dominios enriquecidos en clatrina.

Tomados en su conjunto, nuestros resultados sugieren un papel de la kazrina en la encrucijada de reciclaje en los endosomas de clasificación, favoreciendo el transporte hacia los endosomas perinucleares de reciclaje e inhibiendo la via corta de reciclaje desde los endosomas de clasificación a la membrana plasmática. A nivel molecular, los datos sugieren que la kazrina podría controlar el balance de la polimerización de actina inducida por WASH, inhibiendo la misma sobre los microdominios ricos en retrómero, implicados en la vía corta de reciclaje a membrana plasmática, y promoviéndola en subdominios asociados a clatrina, implicados en el transporte a los endosomas perinucleares.