Caracterització funcional de LOXL2 en el rabdomiosarcoma alveolar

Abstract

El rabdomiosarcoma (RMS) és el sarcoma de parts toves més comú en nens i adolescents que representa un 3-4 % dels càncers infantils. En canvi, és molt menys freqüent en adults. Principalment consisteix en dues variants histològiques: l’embrionari (ERMS) i l’alveolar (ARMS), tot i que hi ha altres variants minoritàries. Molts dels tumors classificats com ARMS (un 80 %) contenen la translocació cromosòmica t(1;13) o t(2;13), on el domini d’unió a l’ADN de PAX3 o PAX7 s’uneix al domini de transactivació de FOXO1, formant les proteïnes de fusió PAX3-FOXO1 i PAX7-FOXO1, respectivament. La metàstasi és el principal factor que limita el pronòstic: en pacients amb metàstasi la supervivència lliure de malaltia als 5 anys cau dràsticament d’un 70 % a un 20-29 %. A més, els pacients amb presència de metàstasi que expressen PAX3-FOXO1 són els que presenten un pitjor pronòstic, on la supervivència als 4 anys és d’un 8 %. LOXL2 (lysyl oxidase-like 2) ha sorgit com un important regulador de la progressió tumoral i el procés metastàtic, esdevenint un fort candidat per tal de desenvolupar inhibidors i teràpies dirigides en diferents càncers. Degut a que LOXL2 s’ha descrit com un factor clau en la progressió tumoral vam decidir caracteritzar la seva expressió i funció en el RMS. LOXL2 es troba àmpliament expressada en línies de RMS i, a més, els pacients amb RMS que expressen LOXL2 presenten una menor supervivència. LOXL2 localitza intracel·lularment i es troba N-glicosilada, modificació essencial per a la seva secreció al medi extracel·lular, on es processada proteolíticament. El conjunt de resultats d’aquest treball evidencien per primer cop que LOXL2 és important en la progressió tumoral i metastàtica del RMS. Aquest fet és de gran rellevància en els pacients amb aquesta malaltia, on la metàstasi limita el seu pronòstic. Els resultats posen de manifest que LOXL2 promou el fenotip neoplàstic en el RMS independentment de la seva activitat catalítica, incrementant la capacitat clonogènica, proliferativa, migratòria, invasiva i metastàtica de les cèl·lules. La caracterització de LOXL2 intra- i extracel·lular és un altre tema de gran importància. En aquesta tesi s’ha confirmat que la N-glicosilació de LOXL2 no solament és essencial per a la seva secreció sinó també per duu a terme algunes de les seves funcions. Concretament, LOXL2 intracel·lular no glicosilat és capaç d’incrementar la capacitat migratòria i invasiva de les cèl·lules, descartant un paper de LOXL2 extracel·lular en aquestes funcions. D’altra banda, aquest mutant no glicosilat i no secretat no és capaç de promoure la capacitat clonogènica i proliferativa de les cèl·lules, ni tampoc amb el tractament amb LOXL2 recombinant humà extracel·lular, suggerint que les N-glicosilacions de LOXL2 afecten aquestes dues funcions. La identificació de nous partners de LOXL2 és de gran rellevància per tal d’incrementar el coneixement de la funció de LOXL2. Per primer cop s’ha descrit la interacció de LOXL2 amb vimentina, proteïna important durant la migració i invasió en el RMS. A més, LOXL2 regula aquesta proteïna del citoesquelet incrementant la seva proteòlisi parcialment deguda a calpaïna-2, proteasa que també interacciona amb LOXL2. Aquests resultats suggereixen que LOXL2 té un paper important en la regulació del citoesquelet en les cèl·lules de RMS promovent la migració, invasió i metàstasi. No obstant, el mecanisme pel qual la interacció LOXL2-vimentina-calpaïna-2 és important s’ha d’examinar amb més detall en el futur. Conjuntament, la inhibició de LOXL2 podria aportar benefici terapèutic en un futur pels pacients de RMS on el tractament convencional, sobretot en pacients amb metàstasi, no resulta efectiu.

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue malignancy in childhood and adolescence. Lysyl oxidase-like 2 (LOXL2) is an amine oxidase that catalyzes the covalent crosslinking of collagen and elastin in the extracellular matrix. Apart from its traditional role, novel functions have been attributed to both intra- and extracellular LOXL2 related to tumor progression. In this thesis we reported that LOXL2 is overexpressed in several RMS cell lines compared to other sarcoma cells. We also functionally characterized LOXL2 in RMS cell lines. LOXL2 stable and transient silencing in RMS cell lines resulted in a decrease in the clonogenic, cell proliferative, migratory and invasive capabilities. On the other hand, the reintroduction of LOXL2 in RMS non-expressing cells (RH28) using wild type or mutated (catalytically inactive) constructs resulted in an increase in the clonogenic capacity, cell proliferation, migration and invasion, independently of its catalytic activity. Moreover, we performed an in vivo assay injecting tumor cells orthotopically at the gastrocnemius muscle of mice and observed that LOXL2-expressing cells had an increased frequency and number of lung metastasis. At the same time, the metastatic capacity was increased independently of LOXL2 catalytic activity. In addition, in order to explore LOXL2 role according its subcellular localization we developed a non-secretable LOXL2 mutant (N-glycosylated sites were mutated) and confirmed that LOXL2 pro-migratory and pro-invasive effects depend on intracellular LOXL2. In contrast, non-glycosylated and non-secretable mutant was not able to increase the clonogenic and proliferative capacities of the cells. Furthermore, in order to decipher the molecular mechanisms associated to LOXL2 oncogenic activity in RMS a pull-down assay on RH28 transfected cells was performed and analyzed using mass spectrometry. Among the results, we confirmed the intermediated filament protein vimentin as a LOXL2-interactor, as well as the relevance of this protein in RMS cell migration and invasion. More interestingly, LOXL2 regulated cytoskeleton dynamics of RMS cells as the reintroduction of LOXL2 in RH28 cells increased the proteolysis of vimentin, process partially dependent on the protease calpain-2, another novel LOXL2-interactor. Finally, more research would be crucial to evaluate the role of LOXL2-vimentin-calpain-2 interaction in tumor progression. Altogether, blocking LOXL2 function may be promising for the treatment of RMS.