Microphysiological systems for modelling and monitoring biological barriers

Abstract

Los sistemas microfisiológicos (MPS) son modelos in vitro microfabricados que emulan las condiciones in vivo fisiológicamente relevantes, como la organización celular y las señales microambientales. Las microtecnologías han permitido el desarrollo de sofisticados MPS capaces de recapitular fielmente la fisiología a nivel de tejido y órgano. Los MPS son particularmente útiles para modelar barreras biológicas, es decir, epitelios y endotelios que separan la circulación sanguínea de los compartimentos tisulares. Su función de barrera es crucial para mantener la homeostasis en los órganos y su desregulación juega un papel importante en la fisiopatología de muchas enfermedades humanas prevalentes. La función principal de un tejido barrera es controlar el transporte transepitelial de solutos. Por lo tanto, la capacidad de cuantificar el transporte en un modelo de barrera es crítico. La espectroscopía de impedancia eléctrica (EIS) permite su cuantificación con las ventajas de ser no destructiva, sin utilizar marcadores y de fácil aplicación en tiempo real. EIS puede determinar 1) la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), que evalúa la integridad de la barrera (estrechamente relacionada con la rigidez del espacio intercelular); 2) la capacitancia de la capa celular (Ccl), que puede proporcionar información sobre el área superficial de la membrana; y 3) la contribución de la solución del medio a la impedancia. Mientras que el EIS es fácil de realizar mediante electrodos extracelulares, es difícil lograr la distribución de corriente uniforme requerida para mediciones precisas dentro de los canales de cultivo celular miniaturizados. Entonces, se puede suponer erróneamente que todo el área de cultivo de células contribuye igual a la medición, lo que puede conducir a errores de cálculo del TEER. Esto puede explicar parcialmente la gran disparidad de los valores de TEER reportados para tipos de células idénticas. Aquí, se presenta un estudio numérico para dilucidar este problema en algunos cultivos celulares previamente reportados y para proponer un factor de corrección geométrica (GCF) que corrige este error y que permite aplicarse retrospectivamente. Este estudio también se usó para optimizar una configuración tetrapolar especialmente adecuada para realizar mediciones EIS precisas en canales microfluídicos, y lo que es más importante, los electrodos cubren mínimamente la superficie lo que permite que las células se puedan visualizar junto con el análisis de TEER. Posteriormente, se desarrolló una cámara de perfusión modular con electrodos integrados en base a esta configuración óptima. El dispositivo comprende una membrana porosa desechable en la que se forma el tejido barrera y dos placas reutilizables donde se encuentran los electrodos. Por lo tanto, el tejido en la membrana se puede ensamblar en el sistema para medirlo y exponerlo al flujo, no solo para aplicar un estímulo mecánico fluidico sino también para suministrar continuamente nutrientes y eliminar los desechos. Además, la concentración de NaCl en ambos lados del tejido se puede estimar a partir de la conductancia eléctrica medida con los mismos electrodos integrados en una configuración bipolar. Un modelo in vitro del túbulo renal se utilizó para validar el sistema de medición. Como resultado, la concentración de NaCl se estimó a partir de la conductancia que permite la medición en línea del gradiente químico transepitelial de NaCl, que es una función primaria del túbulo renal. El desarrollo de MPS con múltiples barreras biológicas interconectadas expandirá la tecnología para recapitular funciones más complejas a nivel de órgano. Sin embargo, existen múltiples desafíos técnicos para reproducir varias barreras biológicas en un solo dispositivo mientras se mantiene un microambiente controlado particular para cada tipo de célula. Aquí se presenta un novedoso dispositivo microfluídico donde 1) múltiples tipos de células que están dispuestas en compartimentos uno al lado del otro están interconectadas con microsurcos y donde 2) múltiples tejidos barrera se miden a través de electrodos metálicos que están enterrados debajo de los microsurcos. Como prueba de concepto, el dispositivo se usó para imitar la estructura de la barrera hematorretiniana (BRB), incluidas las barreras interna y externa. Ambas barreras se formaron con éxito en el dispositivo y se monitorearon en tiempo real, lo que demuestra su gran potencial para su aplicación a la tecnología de órgano en un chip.

Microphysiological systems (MPS) are biologically inspired microengineered in vitro models that emulate physiologically relevant in vivo conditions, such as cell organization and microenvironmental cues. Microtechnologies have enabled the development of significant MPS that are able to faithfully recapitulate tissue- and organ-level physiology. MPS are particularly useful for modelling biological barriers, that is, epithelia and endothelia that separate the blood circulation from tissue compartments. Their barrier function is crucial to maintain organ homeostasis and their deregulation play an important role in the pathophysiology of many prevalent human diseases. The primary function of a barrier tissue is to control the transepithelial transport of solutes. Therefore, the ability to quantify transport in a barrier model is critical. Electrical impedance spectroscopy (EIS) permits its quantification with the advantages of being non-destructive, label-free, and easily applicable in real time. EIS can determine 1) the transepithelial electrical resistance (TEER), which evaluates the barrier integrity (closely related with the tightness of the intercellular space); 2) the cell layer capacitance (Ccl), which can yield information about the membrane surface area; and 3) the contribution of the medium solution to the impedance. While EIS is easy to carry out by means of extracellular electrodes, it is challenging to achieve the uniform current distribution required for accurate measurements within miniaturized cell culture channels. Then, it may be erroneously assumed that the entire cell culture area contributes equally to the measurement leading to TEER calculation errors. This can partially explain the large disparity of TEER values reported for identical cell types. Here, a numerical study is presented to elucidate this issue in some cell cultures previously reported and to propose a geometric correction factor (GCF) to correct this error and be applied retrospectively. This study was also used to optimize a tetrapolar configuration especially suitable for performing accurate EIS measurements in microfluidic channels; importantly, it implements minimal electrode coverage so that the cells can be visualised alongside TEER analysis. A modular perfusion chamber with integrated electrodes was developed based on this optimal configuration. The device comprises a disposable porous membrane where the barrier tissue is formed and two reusable plates where the electrodes are located. Therefore, the tissue on the membrane can be assembled into the system to be measured and exposed to flow—not only to apply a fluid mechanical stimuli but also to continuously supply nutrients and remove waste. Additionally, the concentration of NaCl in both sides of the tissue can be estimated from the electrical conductance measured with the same integrated electrodes in a bipolar configuration. An in vitro model of the renal tubule was used to validate the measurement system. As a result, the concentration of NaCl was estimated from the conductance enabling in-line measurement of the transepithelial chemical gradient of NaCl, which is a primary function of the renal tubule. The development of MPS with multiple interconnected biological barriers will expand the technology to recapitulate more complex organ-level functions. Unfortunately, there are multiple technical challenges to reproduce several biological barriers in a single device while maintaining a particular controlled microenvironment for each cell type. Here, it is presented a novel microfluidic device where 1) multiple cell types that are arranged in side-by-side compartments are interconnected with microgrooves and where 2) multiple barrier tissues are measured through metal electrodes that are buried under the microgrooves. As a proof-of-concept, the device was used to mimic the structure of the blood-retinal barrier (BRB) including the inner and the outer barriers. Both barriers were successfully formed in the device and monitored in real time, demonstrating its great potential for application to organ-on-achip technology.