Structure insights into the autoinhibitory mechanism of the deubiquitinating enzyme USP25 and into the SUMO E1-E2 protein-protein recognition

Abstract

La ubiquitinació i la SUMOilació són dos de les modificacions post-traduccionals més estudiades (PTM). En aquesta tesi, ens hem centrat en estudiar USP25, USP28 i en el reconeixement proteïna-proteïna dels enzims SUMO E1-E2 d’aquestes dues vies PTM. USP25 i USP28 són de-ubiquitinases que tenen papers importants en processos cel·lulars i les seves activitats enzimàtiques estan regulades per diversos PTMs, incloent SUMOilació, ubiquitinació i fosforilació. La interacció proteïna-proteïna de SUMO E1-E2 és un pas essencial de discriminació en la via de la conjugació. En aquesta tesi, els principals objectius inclouen l'elucidació de les bases estructurals de la regulació de l'activitat de USP25 i USP28, així com poder desxifrar els determinants estructurals en l'especificitat proporcionada per la interacció SUMO E1-E2. Hem resolt l'estructura cristal·lina de la USP25 humana (18 - 714). Sorprenentment, USP25 mostra una estructura quaternària homotetramèrica que està directament implicat en la inhibició de la seva activitat enzimàtica, i revela un nou mecanisme de tetramerització/inhibició. Assaigs bioquímics i cinètics in vitro amb construccions de dímer, tetràmer de USP25 donen suport a aquest mecanisme, mostrant en tots els casos una major activitat catalítica en el dímer. A més, la forta estabilització de les tankirases en cèl·lules en cultiu mitjançant l'expressió ectòpica del dímer de USP25 verifica la rellevància biològica d'aquest nou mecanisme de tetramerització/inhibició. Pel que fa a la interacció E1 UFD - E2, hem resolt l'estructura cristal·lina del complex E1 UFD - E2 tant en humans com en A. thaliana. Tot i la baixa homologia de seqüència presentada en la superfície d’interacció de UFD entre especies, la comparació estructural entre complexos revela determinants comuns en les interfícies entre humans, llevats i A. thaliana. La comparació estructural també revela una forta conservació en la superfície d’interacció de les E2 entre espècies, tot i la forta especificitat mostrada en assajos de conjugació de SUMO en a cada organisme. Curiosament, hem trobat residus de la E2 fora de la superfície d’interacció amb UFD que tenen un impacte en la conjugació de SUMO, el que suggereix la presència d’altres determinants estructurals diferents als de la superfície d’interacció entre E2 i E1 UFD en l'especificitat de la conjugació de SUMO.

Ubiquitination and SUMOylation are of the most studied post-translational modifications (PTMs). Here, we focus on USP25, USP28, and the SUMO E1-E2 protein-protein recognition in these two PTM pathways. USP25 and USP28 have important roles in cellular processes, and their enzymatic activities are regulated by diverse PTMs including SUMOylation, ubiquitination, and phosphorylation. SUMO E1-E2 protein-protein interaction is a major discrimination step in the conjugation pathway. In this thesis, the main goals include the elucidation of the structural basis for the activity regulation of USP25 and USP28, as well as to decipher the structural determinants for the specificity provided by the E1 UFD-E2 interaction. We have solved the crystal structure of human USP25 (18 – 714). Unexpectedly, USP25 displays a homotetrameric quaternary assembly that is directly involved in the inhibition of its enzymatic activity, revealing a novel tetramerization/inhibition mechanism. In vitro biochemical and kinetic assays with dimer, tetramer and truncation constructs of USP25 support this mechanism, displaying in all cases a higher catalytic activity in the dimer assembly. Moreover, the strong stabilization of tankyrases in cultured cells by the ectopic expression of the USP25 dimer verifies the biological relevance of this novel tetramerization/inhibition mechanism. Regarding to the E1 UFD-E2 interaction, we have solved the crystal structure of the E1 UFD-E2 complex in both human and A. thaliana. Despite the low sequence homology displayed by the UFD binding interface, structural comparison between complexes reveals common determinants in the interfaces between human, yeast, and A. thaliana. Structural comparison also reveals a strong conservation in the E2 binding interface across species, despite the strong specificity displayed in SUMO conjugation assays for each organism. Interestingly, E2 residues outside the UFD interface had impact on SUMO conjugation, suggesting the contribution of determinants other than the primary UFD binding interface in the specificity of the conjugation system.