Improvement of Protocols for Brain Cancer Diagnosis and Therapy Response Monitoring Using Magnetic Resonance Based Molecular Imaging Strategies

Abstract

Los tumores cerebrales constituyen menos del 2% de los tumores primarios, pero son uno de los peores tipos de cáncer en cuanto a “años de vida perdidos”. Los gliomas son los tumores cerebrales más prevalentes, con una esperanza de vida inferior a 15 meses para los casos de alto grado, como los glioblastomas (GBM). El método no invasivo más utlilizado para diagnóstico y seguimiento de la respuesta a la terapia en tumores cerebrales es la Resonancia Magnética (MR), en forma de imagen (MRI) y espectroscopía (MRS) o imagen espectroscópica (MRSI). Sin embargo, debido a restricciones éticas relacionadas a la participación de pacientes humanos en investigación, la optimización de los métodos de diagnóstico y seguimiento de la terapia requieren modelos preclínicos que reproduzcan las patologías humanas. Para este tipo de estudios, se utilizan principalmente modelos murinos, que pueden dividirse en modelos genéticamente modificados (GEM) con desarrollo espontáneo de tumor y los modelos de generación de tumores por inyección estereotáxica de líneas celulares. En la presente tesis, se llevó a cabo una detallada caracterización de dos colonias GEM, S100β-v-erbB/inK4a-Arf (+/-) y GFAP-V12 HA-ras B8. Se observó una baja penetrancia de desarrollo de tumores (16% y 1% respectivamente), haciendo de éstos una herramienta poco útil para estudios de respuesta a la terapia. La escasez de modelos preclínicos de grado bajo/intermedio sirvió de motivación para desarrollar un modelo de tumor glial transplantable con esas características, por disgregación de tumores provenientes de la colonia GEM. Ello nos debería permitir obtener una mayor incidencia tumoral en comparación con las colonias GEM. Se generaron gliosferas a partir de tumores GEM de grado III y se logró más de un 60% de penetrancia cuando estas células fueron inyectadas estereotácticamente en el estriado de ratones C57BL/6. Sin embargo, la aplicación de protocolos de descongelación y cultivo a éstas células ocasionó una progresión a grado IV (GBM), lo que sugiere que el modelo generado constituye, potencialmente, un modelo murino de GBM secundario. Además, este modelo transplantable fue ampliamente caracterizado por métodos de MRI/MRSI, así como por métodos de perturbación del patrón espectral con MRSI (PE-MRSI) para una posible aplicación en el desarrollo de clasificadores de respuesta a la terapia en tumores. También se llevó a cabo una evaluación genética restringida de los modelos murinos seleccionados (p.e. tumores GL261, línea celular GL261, GEM y tumores derivados de GEM), utilizando el método de secuenciación de Sanger para comprobar la presencia de mutaciones normalmente presentes en gliomas (en los genes IDH1, IDH2 y p53). Finalmente, esta tesis describe la estrategia desarrollada para estudios longitudinales de detección de respuesta temprana a la terapia/recidiva en tumores preclínicos, utilizando métodos de imagen molecular basados en MRSI. Así ratones implantados con tumores GL261 (glioblastoma) recibieron tratamiento con temozolamida (TMZ), basándonos en protocolos previamente establecidos. La detención del crecimiento tumoral (respuesta a la terapia) fue detectada por MRI. Tanto animales tratados como animales control fueron estudiados por MRSI y técnicas de reconocimiento de patrones (extracción de fuentes en sistema semi-supervisado). Las fuentes extraídas de regiones de interés fueron capaces de distinguir entre tumores GL261 proliferando activamente y tumores respondiendo a la terapia, basándose en cambios de patrón del metaboloma registrado por MRSI. Se obtuvieron mapas nosológicos codificados en tipo e intensidad de color durante y después de la terapia, lo que permitió un seguimiento de la respuesta, así como la detección de heterogeneidad intratumoral en dicha respuesta, siendo capaces de detectar la detención del crecimiento tumoral y la recidiva antes de los cambios observados en el volumen tumoral por MRI. Esta metodología fue ratificada por análisis histopatológico y cálculo de tasas de proliferación, apoptosis y de índice mitótico.

Brain tumours account for less than 2% of all primary tumours, but are one of the most lethal cancers when “life lost” years are considered. Gliomas are the most prevalent type with a median life expectancy below 15 months for the high grade ones, such as glioblastomas (GBM). The most common non-invasive medical technique used for tumour diagnosis and therapy monitoring of brain tumours patients is Magnetic Resonance (MR), in the form of imaging (MRI) and spectroscopy (MRS) or spectroscopic imaging (MRSI). However, due to the ethical restrictions regarding the use of human patients for research study, the improvement of diagnostic and therapy follow-up protocols requires reliable models that mimic human disease. In this regard, mainly murine models are used and can be divided into the genetically engineered model (GEM) of spontaneous tumour development and the engrafted tumour model. In this thesis, a comprehensive MR characterization of two GEM colonies, namely S100β-v-erbB / inK4a-Arf (+/-) and GFAP-V12 HA-ras B8, was carried out. A low tumour penetrance found (16% and 1%, respectively) together with stochastic onset of GEM tumours, made them impractical for use in therapy response studies. The latter and the scarcity of low/intermediate grade brain tumour preclinical models motivated us to attempt to develop a transplantable glial tumour model of low/intermediate grade by disaggregation of a tumour mass from GEM. This should allow us to obtain an increased tumour incidence rate in comparison to GEM animals. Gliospheres from a grade III GEM tumour were successfully generated and displayed more than 60% penetrance, when stereotactically injected into the striatum of C57BL/6 mice. However, the application of freezing and cell culture protocols produced a progression to grade IV GBM, which made the developed transplantable model qualify as potential secondary GBM model in mice. Additionally, this transplantable model was widely characterized using MRI/MRS methods, as well as perturbation-enhanced MRSI (PE-MRSI) for a possible application in the future in therapy strategies and development of tumour therapy response detection classifiers. A restricted genetic evaluation of selected murine tumour models (i.e. GL261 tumours, GL261 cell line, GEM and GEM-derived tumours) was carried out using the Sanger method to check for a possible presence of particular driver mutations commonly occurring in gliomas (IDH1, IDH2 and p53). Finally, the work describes the strategy followed for longitudinal therapy studies follow-up and early response/relapse detection in preclinical brain tumours, through molecular imaging methods based in MRSI. GL261 (glioblastoma) tumour bearing mice were treated with temozolomide (TMZ), based on previously established protocols. The expected transient growth arrest (response to therapy) was detected by MRI. Animals subjected to therapy and control animals were followed up by MRSI and pattern recognition techniques (semi-supervised source extraction) were applied. The sources extracted from the region of interest were able to discriminate between GL261 tumours actively proliferating and tumours responding to therapy, based on their metabolome pattern changes recorded by MRSI. Colour-coded nosological images produced throughout and after the course of therapy allowed convenient tracking of response changes and differentiated the intratumoural heterogeneity of response, hinting the growth arrest and relapse, before changes in tumour volume were observed by MRI. The methodology was validated with histopathological analysis and calculation of proliferation and apoptotic rates and mitotic index.