Designing advanced nanomaterials for next generation in vitro diagnostics: development of optical and electrochemical biosensors for determination of viral and bacterial infections based on hollow AuAg nanoparticles

Abstract

En esta tesis doctoral. El dibujo racional de nanomateriales avanzados con propiedades controladas se aplicó para su empleo en biosensing, y condujo al desarrollo de dos plataformas diagnosticas para la determinación de infecciones virales y bacterianas. Primero, se desarrolló un método sintético altamente reproducible y robusto para la producción de nanoshells de una aleación AuAg monodispersas basado en remplazamiento galvánico. El protocolo descrito permite el controlo preciso sobre la morfología de las partículas, en términos de grosor de la capa externa y de tamaño del vacío interior, la composición relativa y distribución topológica de los metales noble constituyentes, y su rugosidad y porosidad superficial. Esta predictibilidad sintética, testeada sobre un rango de tamaños, se ha conseguido a través de un estudio sistemático de la relación entre de cada reactivo, juntos a una detallada caracterización de la composición y estructura del material con diferentes técnicas. Además, el análisis de las propiedades plasmonicas de las NSs de AuAg durante su transformación estructural, que se extiende por casi todo el espectro visible hasta las longitudes de ondas del Near-Infrared, reveló una dependencia estricta con sus características morfológicas y composicionales. Estos resultados, también confirmados con cálculos basados en la teoría de Mie, proveyeron la base para su aplicación como amplificadores de señal en un immunoensayo basado en SERS. Segundo, por la primera vez el comportamiento electroquímico de las NSs de AuAg fe reportado. Causado por la corrosión controlada de átomos de Ag contenidos en los núcleos residuales de las partículas y las capas finas de aleación, el estudio voltametrico de estos nanocristales vacíos se reveló fuertemente dependiente de su composición elemental relativa y, parcialmente, de su tamaño y morfología. Un efecto electrocatalitico peculiar apareció solamente para NSs de AuAg con un ratio Au/Ag suficiente para permitir la electrodeposición catalítica de Ag+ encima de la superficie de las partículas a potenciales menos negativos que el potencial de redacción estándar de Ag. Este comportamiento no previamente reportado está causado solo por el carácter levemente oxidante del electrolito utilizado, sin la necesidad de ningún otro co-reactivo u oxidante. Estos resultados constituyeron la base racional para desarrollar NSs de AuAg con propiedades desiderables para su aplicación en el ensayo electroquímico descrito. Aventajándose de las propiedades plasmonicas de las NSs de AuAg, el desarrollo de un ensayo immunocromatografico basad ene SERS para la detección sensible y cuantitativa de MxA, un biomarcador comúnmente asociado a infecciones virales, fue realizado. Gracias a las intensidades plasmonicas amplificadas enseñadas por las NSs de AuAg, resultante por el efecto de cavidad plasmonica comúnmente observado in nanoestructuras vacias, su superifices se portan como un continuo hot-spot, amplificando cualquier señal Raman emitido por reporters inmovilizados encima. Además, la posibilidad de ajustar precisamente la longitud máxima de LSPR de las NSs de AuAg de manera de coincidir con el láser NIR durante la mesura SERS permitió de mejorar la performance analítica. Entonces, las NSs de AuAg fueron fácilmente conjugadas con anticuerpos anti-MxA e integrados en un ensayo immunocromatografico para revelar su presencia en muestras de suero. Después de atenta optimización de los parámetros de la plataforma point-of-care, al proteína MxA pudo ser detectada a un limite de detección de pocos ng/mL. En fin, la capacidad de modular precisamente la composición elemental de las NSs de AuAg portó al diseño de un ensayo electroquímico para la detección rápida de dos bacterias modelos, Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Las NSs de AuAg se utilizaron como reporters electroquímicos por la facilidad de generar la señal electroquímica, causada solamente por el carácter levemente oxidante de la matriz biológica. Por otro lado, el recubrimiento polimérico de las partículas confirió la interacción non específica basada en afinidad con las células bacterianas en solución, evitando de necesitar anticuerpos caros y frágiles. A través de esta estrategia de bajo coste, E.coli puso ser detectado en PBS a concentraciones de 102 CFU/mL, mientras también se consiguió la discriminación semi-selectiva de los perfiles corriente-concentración de las dos bacterias modelos.

In this PhD thesis, the rational design of advanced nanomaterials with controlled properties was applied for their employment in biosensing, leading to the development of two diagnostic platforms for the determination of viral and bacterial infections. Firstly, a highly reproducible and robust synthetic method for the production of monodisperse AuAg alloy NSs based on GRR was developed. The protocol described allows the precise control over the particles’ morphology, in terms of shell thicknesses and void sizes, the relative composition and topological distribution of their constituting noble metals, as well as their surface roughness and porosity. This synthetic predictability, tested over a range of sizes, has been achieved through a systematic study of the convoluted interplay of each co-reagent, together with a detailed characterization of the material’s composition and structure through an array of techniques. Moreover, the analysis of AuAg NSs’ plasmonic properties evolution during their structural transformation, which spanned through almost the whole visible spectrum up to NIR wavelengths, revealed a tight dependence with their morphological and compositional features. These results, also confirmed by calculations based on Mie’s theory, provided the basis for their application as signal enhancers in the SERS-based LFA developed. Secondly, for the first time the electrochemical behavior of AuAg NSs was reported. Triggered by the controlled corrosion of Ag atoms contained in the particles’ residual cores and thin alloy shells, the voltammetric study of these hollow nanocrystals has been found to be strongly dependent on their relative elemental composition and, partially, to their size and morphology. Indeed, a peculiar electrocatalytic effect appeared only for AuAg NSs possessing a high-enough Au/Ag ratio to let the catalytic electrodeposition of Ag+ on the NSs’ surfaces occur at potentials less negative than Ag standard reduction one. Interestingly, this unreported feature was shown to be triggered only by the mild oxidating character of the electrolyte used, without the need of any other co-reagent or oxidizer. These findings constituted the rational basis for developing AuAg NSs with desirable properties to be applied in the electrochemical assay described. Taking advantage of the tunable plasmonic properties of AuAg NSs, the development of a SERS-based LFA for the sensitive and quantitative detection of MxA, a biomarker commonly associated to viral infections, was achieved. Thanks to the enhanced plasmons intensities displayed by AuAg NSs, resulting from the plasmonic cavity effect commonly observed in hollow nanostructures, their surfaces acted as a continuous hot-spot, amplifying any Raman signal emitted by the reporters thereby attached. Moreover, the possibility to precisely adjust AuAg NSs’ LSPR maximum wavelength to match the NIR excitation laser used during SERS measurements allowed to further improve the overall analytical performance. Thus, AuAg NSs were easily conjugated with anti-MxA antibodies and integrated in a LFA in order to reveal its presence in spiked serum samples. After careful optimization of the point-of-care platform parameters, MxA protein could be successfully detected down to the analytically-relevant LOD of few ng/mL. Finally, the capability to precisely modulate AuAg NSs elemental composition lead to the design of a proof-of-concept electrochemical assay for the rapid detection of two model bacterial strains, Escherichia coli and Salmonella typhimurium. AuAg NSs were used as electrochemical reporters because of the ease of generation of the electrochemical signal, triggered by the sole mild oxidating character of the biological sample matrix. Besides, the polymeric coating of the hollow particles provided the non-specific, affinity-based interaction with bacterial cells in solution, avoiding the need for costly and fragile antibodies. With this low-cost strategy, E.coli could be detected in PBS down to 102 CFU/mL, while the semi-selective discrimination of the current-concentration profiles of the two model bacterial strains was also achieved.