Posicionament cromosòmic en cèl·lules de l’espermatogènesi de Mus musculus

Abstract

Els cromosomes ocupen regions específiques del nucli anomenades territoris cromosòmics. En cèl·lules somàtiques, el posicionament dels cromosomes està condicionat per la densitat gènica, l’activitat transcripcional i el contingut de guanina-citosina. Aquestes associacions evidencien l’existència d’una relació funcional entre la territorialitat cromosòmica i l’expressió gènica. Disposem de poques dades sobre el posicionament cromosòmic durant l’espermatogènesi. Alguns autors suggereixen que la distribució dels cromosomes en cèl·lules espermatogèniques podria condicionar el correcte desenvolupament de l’espermatogènesi i tenir implicacions en l’expressió gènica de l’embrió. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral va ser establir un model tridimensional de la territorialitat cromosòmica durant les diferents fases del procés de l’espermatogènesi de Mus musculus. Per assolir aquest objectiu es va desenvolupar una metodologia per a l’estudi tridimensional del posicionament cromosòmic en cèl·lules germinals i espermatozoides amb la finalitat de descriure el posicionament i identificar els factors que regulen la territorialitat dels cromosomes en aquests tipus cel·lulars. Es va utilitzar teixit testicular procedent d’individus de la soca C57BL/6J de Mus musculus. La metodologia desenvolupada va consistir en l’aplicació dels següents procediments: i) fixació cel·lular preservant la tridimensionalitat nuclear, ii) hibridació in situ fluorescent de tots els cromosomes de ratolí, iii) captura d’imatges amb microscòpia confocal, iii) identificació cel·lular mitjançant immunofluorescència, iv) anàlisi d’imatges utilitzant el programa Matlab, v) obtenció de dades numèriques i anàlisi estadística. Aquesta metodologia va permetre l’estudi del posicionament de tots els cromosomes del genoma de ratolí en cinc estadis cel·lulars que cobreixen la totalitat del procés espermatogènic: espermatogoni-preleptotè inicial, espermatòcits I a l’estadi de preleptotè mitjà-zigotè, espermatòcits I a l’estadi de paquitè, espermàtides rodones i espermatozoides. Per cada estadi es van obtenir dades del volum de cada cromosoma, la posició dels cromosomes en relació a l’eix centre-perifèria nuclear i les freqüències d’encavalcament entre cromosomes. Els resultats van posar de manifest que el posicionament radial i relatiu dels cromosomes durant l’espermatogènesi és dinàmic i no aleatori. Són nombroses les evidències observades que permeten concloure que els esdeveniments cromosòmics que condueixen a la recombinació meiòtica determinen la dinàmica de posicionament dels cromosomes homòlegs des de l’etapa d’espermatogoni fins a l’etapa de paquitè. En aquest sentit s’ha observat que els cromosomes homòlegs comparteixen el mateix territori cromosòmic en etapes properes a l’inici de la meiosi. A més, l’estructura de bouquet condiciona l’organització territorial del nucli a l’etapa de paquitè en funció de la mida cromosòmica, observant-se els cromosomes més petits preferentment a la part perifèrica del nucli. D’altra banda, l’anàlisi dels resultats indica que l’activitat gènica és un paràmetre que condiciona el posicionament radial dels cromosomes durant tot el procés de l’espermatogènesi. La part interna del nucli presenta una concentració de material genètic superior al valor esperat. A més, els cromosomes amb més quantitat de gens implicats en el procés de l’espermatogènesi o espermiogènesi (en el cas de les espermàtides rodones), mostren més volum cromosòmic a la zona mitja-interna del nucli. Finalment, hem observat que els cromosomes sexuals presenten un posicionament radial dinàmic durant l’espermatogènesi, directament relacionat amb els processos d’inactivació transcripcional que experimenten al llarg del procés. En relació al posicionament relatiu entre cromosomes, els resultats van mostrar que les interaccions entre cromosomes al nucli de les cèl·lules germinals i dels espermatozoides no són aleatòries suggerint implicacions funcionals rellevants. Tot i així, no s’han identificat els factors que determinen aquesta posició relativa a excepció de l’efecte de la mida en l’estadi de paquitè i en les espermàtides rodones. Finalment, també s’ha pogut concloure que el posicionament dels cromosomes respecte l’eix longitudinal del nucli dels espermatozoides no és aleatori suggerint la importància d’un posicionament longitudinal ordenat pels processos d’alliberament i activació del genoma patern desprès de la fecundació.

Chromosomes occupy specific regions of the nucleus called chromosome territories. In somatic cells, the positioning of the chromosomes is conditioned by gene density, transcriptional activity and the guanine-cytosine content. These associations demonstrate the existence of a functional relationship between chromosomal territoriality and gene expression. Little is known about chromosomal positioning during spermatogenesis. Some authors have suggested that the chromosomes distribution in spermatogenic cells could affect spermatogenesis development and have implications for embryo gene expression. The objective of this doctoral thesis was to establish a three-dimensional model of chromosomal territoriality during the different stages of the Mus musculus spermatogenesis. To achieve this objective, we have developed a methodology for performing three-dimensional study of chromosomes positioning in germ cells and spermatozoa with the aim to describe the chromosome positioning, and to identify the factors that regulate the territoriality of the chromosomes in these cell types. Testicular tissue from individuals of C57BL6J Mus musculus strain was used. The methodology developed consisted in the following procedures: i) optimized cell fixation to preserve the three-dimensionality of the nuclei, ii) fluorescence in situ hybridization of all mouse chromosomes, iii) three-dimensional image captures by confocal microscopy, iii) cell identification by immunofluorescence iv) image analysis using Matlab, v) numerical data extraction and statistical analysis. This methodology allowed the study of all chromosomes positioning of the mouse genome in five cellular stages, which cover the whole spermatogenic process: spermatogonia-early preleptotene, spermatocytes I at mid preleptotene-zygotene stages, spermatocytes I at pachytene stage, round spermatids and spermatozoa. For each stage, data of the nuclear volume occupied by each chromosome were obtained, the position of chromosomes according to the central-peripheral nuclear axis and the overlapping frequency between chromosomes. Results showed that radial and relative positioning of chromosomes during spermatogenesis is dynamic and non-random. Several evidences were observed indicating that the chromosomal events that lead to meiotic recombination determine the dynamics of homologue chromosomes position from spermatogonia to pachytene stage. In this sense, it has been observed that homologous chromosomes share the same chromosomal territory in stages near the beginning of meiosis. In addition, the bouquet distribution affects the territoriality organization of the nucleus at pachytene stage in accordance to chromosomal size, being the smallest chromosomes preferably observed in the nucleus periphery. On the other hand, several pieces of data suggest that gene activity is closely associated with the radial positioning of chromosomes throughout the spermatogenesis process. For instance, the nucleus interior presents a higher concentration of genetic material than the expected value. In addition, chromosomes with more number of genes involved spermatogenesis process or spermiogenesis (in the case of round spermatids), show more chromosomal volume in the middle-internal area of ​​the nucleus. Finally, we have observed that sex chromosomes present a dynamic radial positioning during spermatogenesis, directly related to the transcriptional inactivation processes that they experience throughout the process. In relation to the relative positioning between chromosomes, the results showed that the interactions between chromosomes in the nucleus of germ cells and spermatozoa are not random, suggesting relevant functional implications. Even so, it has not been identified any factors that determine the relative position to the exception of the effect chromosome size at pachytene stage and round spermatids. Finally, it has also been concluded that the chromosome positioning in relation to the longitudinal axis of the sperm nucleus is not random, suggesting the importance of an ordered longitudinal positioning for the processes of release and activation of the paternal genome after fertilization.