Oocyte competence: Study of melatonin and meiotic inhibitors to improve in vitro embryo production in juvenile goats

Abstract

La producción in vitro de embriones (PIVE) tiene su mayor limitación en la eficacia de la maduración in vitro (MIV) de los oocitos. La MIV altera la competencia de los oocitos debido al efecto perjudicial de los radicales de oxígeno (ROS) y a la reanudación rápida y espontanea de la meiosis. En oocitos de cabras de 1 a 2 meses de edad, estos dos factores son más intensos y perjudiciales. En esta tesis, se plantearon dos estrategias para mejorar los protocolos de MIV en estos oocitos: A) Suplementar el medio de MIV con melatonina como potente antioxidante para disminuir los ROS; B) Diseñar un sistema bifásico de MIV con una fase de pre-maduración (pre-MIV) con inhibidores de la meiosis, seguida por una segunda fase de MIV convencional. El efecto de la melatonina fue evaluado en dos estudios. En el primero, se testaron diferentes concentraciones de melatonina (10-11, 10-9, 10-7, 10-3 M) en el medio de MIV. La suplementación con 10-7 M de melatonina aumentó el porcentaje de blastocistos (28.9% vs. 11.7% en el control) y redujo el nivel intra-oocitario de ROS. En el segundo estudio, evaluamos los mecanismos de acción de la melatonina (10-7 M) en los oocitos y detectamos la presencia del receptor de melatonina 1 (MT1) en oocitos y células del cúmulo mediante inmunocitoquímica. La melatonina incrementó la actividad mitocondrial y el ATP de los oocitos, redujo los ROS y mejoró la calidad de los blastocistos producidos in vitro (55.8 vs. 30.4 células de la masa celular interna), comparado con el grupo control sin antioxidantes. No pudimos determinar si estos efectos son mediados por el MT1 porqué el grupo melatonina más lucindol (antagónico del MT1) no mostró diferencias significativas respeto los grupos melatonina y control. La estrategia para mejorar la competencia de los oocitos mediante una pre-MIV con inhibidores meióticos se desarrolló en dos estudios. El primer estudio se llevó a cabo en la Universidad de Adelaida (Australia) en oocitos de bovino adulto. Evaluamos el efecto de distintas concentraciones del péptido natriurético tipo C (CNP; 50, 100, 200 nM) y el 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; 500 µM) sobre el arresto meiótico durante 6 y 24 h. El cultivo de pre-MIV con CNP (100 nM) más IBMX durante 6 horas obtuvo el mayor efecto de parada meiótica (92% de oocitos en vesícula germinal; VG). A continuación, diseñamos un sistema bifásico utilizando este protocolo de pre-MIV, seguido de 20 h de MIV convencional, y comparamos con una MIV control (24 h). La MIV bifásica prolongó la comunicación entre células del cúmulo y oocito, evaluada mediante la densidad de proyecciones de transzona (TZP), mejoró la actividad mitocondrial y aumentó la producción de blastocistos (45.1% vs. 34.5%). En el segundo estudio, analizamos un sistema similar en oocitos de cabras de 1 a 2 meses de edad. Primero, evaluamos el efecto de distintas dosis de CNP (50, 100, 200 nM) con o sin la adición de 10 nM de estradiol. La pre-MIV con CNP (200 nM) más estradiol mantuvo un 74.7% de oocitos en VG y una alta densidad de TZP durante 6 h. En segundo lugar, cultivamos los oocitos con MIV bifásica (6 h pre-MIV más 24 h MIV) comparado con MIV control (24 h). La MIV bifásica incrementó el glutatión intra-oocitario y disminuyó los ROS, aumentó la expresión de DNA metiltranferasa 1 y proteína 6 estimuladora de TNF en complejos cúmulo-oocito (COCs), y mejoró la producción de blastocistos (30.2% vs. 17.2%). En conclusión, la MIV con melatonina y la pre-MIV con inhibidores meióticos son métodos que pueden mejorar sustancialmente la competencia de los oocitos de hembras muy jóvenes para producir embriones in vitro.

Oocyte in vitro maturation (IVM) is a limiting step for the in vitro embryo production (IVEP). Conventional IVM can impair oocyte competence due to the damaging effect of reactive oxygen species (ROS) and the rapid and spontaneous meiotic resumption. These two factors are more intense and damaging for oocytes of juvenile goats (1-2 months old). In the present thesis, we hypothesized that two different strategies could improve IVM protocols in these oocytes: A) Supplementing the IVM medium with melatonin as a powerful antioxidant in order to reduce ROS; B) Designing a biphasic IVM system including a pre-maturation (pre-IVM) culture phase with meiotic inhibitors, followed by a conventional IVM phase. The effect of melatonin was evaluated in two studies. In the first study, various melatonin concentrations (10-11, 10-9, 10-7, 10-3 M) were tested in the IVM medium. The supplementation with 10-7 M of melatonin increased the blastocyst rate (28.9% vs. 11.7% in control) and decreased intra-oocyte ROS levels after IVM. In the second study, the mechanisms of action of melatonin (10-7 M) in the oocyte were assessed and the presence of melatonin receptor 1 (MT1) was detected in oocytes and cumulus cells by immunocytochemistry. Melatonin increased oocyte mitochondrial activity and ATP content, decreased intra-oocyte ROS levels, and improved blastocyst quality (55.8 vs. 30.4 cells in the inner cell mass), compared to control group without antioxidants. However, we could not determine if these effects were mediated by MT1 because IVM with melatonin plus luzindole (an inhibitor of MT1) showed no significant differences compared to melatonin and control groups. The strategy for improving oocyte competence during a pre-IVM culture with meiotic inhibitors was also developed in two studies. The first study was performed at the University of Adelaide (Australia) with oocytes from adult cow. We evaluated the effect of various concentrations of C-type natriuretic peptide (CNP; 50, 100, 200 nM) and 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; 500 µM) on oocyte meiotic arrest during 6 and 24 h. Pre-IVM culture with CNP (100 nM) plus IBMX for 6 h showed the greater effect on the meiotic arrest (92% of oocytes in germinal vesicle; GV). We developed a biphasic IVM system using this pre-IVM protocol followed by 20 h of conventional IVM, and compared to control IVM (24 h). Biphasic IVM prolonged cumulus-oocyte communication assessed by the density of transzonal projections (TZP), improved oocyte mitochondrial activity and increased blastocyst rate (45.1% vs. 34.5%). In the second study, a similar biphasic IVM system was tested in juvenile-goat IVEP. First, the effect of various CNP doses (50, 100, 200 nM) were tested with and without the addition of 10 nM estradiol. Pre-IVM with CNP (200 nM) plus estradiol sustained 74.7% of oocytes in GV and a high density of TZPs during 6 h. Second, oocytes were cultured with biphasic IVM (6 h pre-IVM plus 24 h IVM) compared to control IVM (24 h). Biphasic IVM increased intra-oocyte glutathione levels and decreased ROS, up-regulated the expression of DNA methyltransferase 1 and TNF-stimulated gene 6 protein in cumulus-oocyte complexes (COCs), and improved blastocyst rate (30.2% vs. 17.2%). In conclusion, IVM with melatonin and pre-IVM with meiotic inhibitors are promising methods that can considerably improve the oocyte developmental competence of very young females for producing embryos in vitro.