Towards improvement of preclinical glioblastoma management: detection, therapy and assessment of response using magnetic resonance techniques

Abstract

El Glioblastoma (GB) es el tumor primario agresivo más común, con mal pronóstico y sin cura actualmente. Aunque se aplique tratamiento agresivo (quimioterapia con Temozolamida, TMZ, y radioterapia) generalmente hay recidiva. Esta tesis se ha centrado en la mejora del diagnóstico, seguimiento de la respuesta a terapia y manejo del GB con técnicas de resonancia magnética (RM) (Imagen por Resonancia Magnética/IRM e Imagen Espectroscópica por Resonancia Magnética/IERM), utilizando el modelo preclínico de GB GL261. Los agentes de contraste (AC) utilizados para diagnóstico de GB están basados en Gadolinio (Gd), que no está exento de riesgo en caso de patología renal. La mayoría de sus efectos se aprecian en IRM T1, aunque estudios recientes señalan las ventajas de ACs del tipo dual (T1-T2). En esta tesis, un conjunto de AC noveles se ha evaluado en colaboración con el ICN2 (Institut Català de Nanociència i Nanotecnologia) mediante una aproximación experimental ex vivo para seleccionar el mejor agente para estudios dinámicos de contraste in vivo. Las imágenes de algebra “dual enhancement” resaltan las propiedades duales de los CA estudiados. Se seleccionó un agente basado en hierro, resultando seguro en estudios de tolerabilidad y mostrando contraste en T1 y T2 in vivo en un período de tiempo corto. Ello permite obtener los dos tipos de información en la misma exploración, lo que conlleva un claro interés translacional. Después del diagnóstico, los GB deben ser tratados y uno de los desafíos de la clínica es el seguimiento de la respuesta. En esta tesis se ha optimizado un análisis volumétrico IERM (tipo 3D) que ha sido aplicado a tumores GL261 controles y tratados con TMZ. Luego, se han generado imágenes nosológicas a partir del análisis semi-supervisado de reconocimiento de patrones, clasificando los tejidos como en respuesta, no respuesta y normal. Hemos establecido el parámetro TRI (del inglés Tumour Responding Index), permitiendo una categorización del nivel de respuesta a partir del porcentaje de tejido respondedor. Los sujetos se han estratificado en categorías arbitrarias: respuesta baja (low response, LR), intermedia (intermediate response, IR) y alta (high response, HR). Estudios histopatológicos confirmaron una relación inversa entre TRI y proliferación Ki67, utilizando células/mm2 en lugar de porcentaje debido a diferencias en morfología/volumen celular. El TRI ha presentado oscilaciones con frecuencia de 6-7 días, en contraposición con el volumen tumoral. Dicha oscilación podría corresponder a la presencia/activación del sistema inmune en la respuesta a la terapia, lo que concuerda con hallazgos histopatológicos de linfocitos infiltrando el tejido respondedor. El potencial de nanopartículas de oro (NP) para hipertermia se ha investigado como tratamiento alternativo para el GB. Para ello, se ha puesto a punto el equipo para irradiación láser (NIR, Near infrared irradiation) dentro del escáner RM, para experimentos ex vivo/in vivo con ratones wt y con tumores GL261. Se han estudiado Nanopartículas de oro huecas y Nanorods obteniéndose resultados discretos en cuanto a calentamiento diferencial. Nanopartículas de oro huecas con PEG no han afectado la viabilidad de células GL261 en cultivo y se han internalizado por un 30% de estas células. A resultas de este estudio, se han formulado una serie de advertencias en relación a la hipertermia: es necesario mejorar la tolerabilidad disminuyendo los valores de endotoxina en las NP; es necesario evitar la subida abrupta de la temperatura cerebral; hay riesgos en la irradiación NIR dentro del escáner y hace falta un sistema de seguridad para evitar incendios; los modelos ortotópicos de tumores cerebrales conllevan desafíos para la consecución de estos estudios, tanto por la necesidad de acúmulo de NP en dichos tumores, como por la disipación de NIR antes de alcanzar la parte interna del cerebro.

Glioblastoma (GB) is the most common and aggressive primary brain tumour with poor prognosis and survival, with no cure available at present. Relapse usually takes place in a short time even after aggressive standard treatment (chemotherapy with Temozolomide, TMZ and radiotherapy). This PhD thesis was focused in the improvement of GB diagnosis, therapy follow-up and management with Magnetic Resonance (MR) techniques (Magnetic Resonance Imaging, MRI and Magnetic Resonance Spectroscopic Imaging, MRSI) in the preclinical GB GL261 mice model. Contrast agents (CA) currently used in GB diagnosis are based in Gadolinium (Gd) which is not exempt of risks in case of patients with renal pathology. In addition, most of its effects are appreciated in T1w MRI although novel studies are pointing to the potential advantages of using dual (T1-T2) agents. In this thesis, a set of novel CA with dual potential was evaluated in collaboration with ICN2 (Institut Català de Nanociència i Nanotecnologia), with a well established path of ex vivo studies for selecting the best agent to proceed with in vivo contrast-enhanced dynamic studies. Dual enhancement MRI image algebra calculated showed the dual properties of candidate CAs. An Fe-based agent was chosen for in vivo studies. This CA proved to be safe in tolerability studies and to show both T1 and T2 effects in a short time frame, allowing to gather both type of data in the same exploration. This type of agents could have clear translational potential in the near future. Once diagnosed, GB should be treated and one of the challenges faced by clinicians is the therapy response follow-up. We have optimized a volumetric, 3D-like MRSI analysis which was applied to GL261 GB tumour-bearing mice either untreated or under TMZ treatment. Then, nosological images were obtained through semi-supervised pattern recognition analysis and classifying tissues in responding, unresponsive or normal. We established the parameter TRI, Tumour Responding Index, which allowed objective categorization of the response level taking into account the percentage of “responding” tissue detected. Mice were then categorized within arbitrary cut-off values: low response (LR), intermediate response (IR) and high response (HR). Histopathological studies confirmed an inverse correlation between the TRI and Ki67 proliferation rate, provided Ki67 cells/mm2 was used instead of percent, due to variable cell morphology and cellular volume. The TRI presented an oscillatory pattern with peak maxima every 6-7 days, as opposed to tumour volume changes. This 6-7 day oscillation would be in agreement with host immune system recruitment for therapy response, also supported by histopathological findings of lymphocyte-like cells infiltrating responding tissue. The potential of gold nanoparticles (NP) for hyperthermia was investigated as an alternative treatment in GL261 GB. For this, a set-up for laser NIR irradiation inside the MR scanner was implemented for hyperthermia ex vivo/in vivo with wt and GL261 tumour-bearing mice. Hollow Gold Nanospheres and Nanorods were studied for heating potential in vitro and ex vivo, achieving discrete results. In vitro studies showed that PEGylated Hollow Gold Nanospheres did not affect GL261 cell viability and were internalized by ca 30% of GL261 cells. Several words of caution resulted from this study, namely: tolerability issues should be improved through new NP synthesis with suitable levels of endotoxin; care should be taken in order to avoid excessive/abrupt brain temperature increase; NIR irradiation inside the MR scanner is not exempt of risks and a whole safety system was developed to prevent fire break incidents; the use of orthotopic brain tumours is challenging for NIR irradiation, due to either need of high accumulation of NP inside tumours and NIR dissipation through tissues until reaching the inner part of the brain.