Análisis del anudamiento del ADN intracelular

Abstract

La mayoría de las transacciones del genoma producen estrés topológico en el ADN, que se reduce gracias a la acción de las topoisomerasas. Por ejemplo, durante la transcripción y replicación del ADN, las topoisomerasas I y II cortan transitoriamente las cadenas de ADN para poder pasar unas a través de otras y relajar así el superenrollamiento del ADN producido por el avance de las polimerasas. Durante la replicación del ADN la actividad de la topoisomerasa II es esencial, ya que elimina los encadenamientos que se generan entre las cromátidas hermanas. Sin embargo, la singular actividad de las topoisomerasas entraña también varios riesgos. Por un lado, los cortes que producen en el ADN son potencialmente dañinos, lo que se ha explotado como diana terapéutica. Por otro lado, su mecanismo de traspaso de cadenas de ADN puede acabar enredando las moléculas de ADN intracelular y producir encadenamientos entre cromosomas o dentro de un mismo cromosoma. Desde los años 80, estudios in vitro han demostrado que el ADN puede anudarse. El análisis de estos nudos ha sido muy útil para determinar propiedades físicas y conformacionales del ADN. Desde entonces, varios estudios han demostrado que la aparición de nudos de ADN es frecuente en plásmidos y cromosomas bacterianos. Sin embargo, en células eucariotas la aparición de nudos en el ADN aún no ha sido documentada. En este sentido, la hipótesis de partida de esta tesis es que, dada la condensación del ADN en las fibras de cromatina y la abundante actividad de la topoisomerasa II en el núcleo celular, la presencia de nudos de ADN en la cromatina es muy probable. Si fuera así, la caracterización de esos nudos sería útil para desvelar nuevos aspectos de la conformación y propiedades biofísicas de las fibras de cromatina in vivo. Esta tesis doctoral constituye un reto de investigación novedoso y original por dos motivos. Primero, se trata del primer estudio sobre nudos de ADN en cromatina nativa y abre, por lo tanto, un campo nuevo en el estudio de la topología del genoma en eucariotas. Segundo, el tipo de experimentos y análisis realizados ha conllevado el desarrollo de nuevas metodologías para el estudio de la topología del ADN intracelular.

In vivo DNA molecules are narrowly folded within chromatin fibers and self-interacting chromatin domains. Therefore, intra-molecular DNA entanglements (knots) might occur via DNA strand passage activity of topoisomerase II. In this thesis, we found that small steady state fractions of DNA knots are common in intracellular chromatin. These knots occur irrespectively of DNA replication and cell proliferation, though their abundance is reduced during DNA transcription. We also found that in vivo DNA knotting probability does not scale proportionately with chromatin length: it reaches a value of 0.025 in domains of 20 nucleosomes, but tends to level off in longer chromatin fibers. We postulate that regulation of topoisomerase II activity and the architecture of chromatin might be crucial to prevent a potentially massive and harmful self entanglement of DNA molecules in vivo. Also, we show the effects of(-) and(+) supercoiling of DNA that naturally builds up in front and behind of DNA transcribing complexes, respectively. Whereas(-) supercoiling barely affects basal fractions of DNA knots, (+) supercoiling produces a burst of DNA knot formation and complexity. Using computing knot formation in chromatin models, we show that large compaction of the nucleosomal fiber reproduces the increase of knot probability and complexity generated by (+) supercoiling of intracellular DNA. These findings clarify why topo II is required for proper synthesis of long transcripts. Although topo I can relax supercoils, only topo II can remove the knots that arise ahead of transcribing complexes. Finally, in this thesis we have developed a high-resolution 2D-gel electrophoresis procedure that quantitatively discerns the fractions of positive- and negative-noded trefoil knots formed in vitro and in vivo systems. Results with minichromosomes in yeast discard a chiral and regular folding of nucleosomal fibers in vivo.