Heat shock proteins: a strategy to improve bovine oocyte vitrification

Abstract

La crioconservació de gàmetes s'ha convertit en una necessitat per a una producció eficient d'animals domèstics, permetent la modificació dels programes de cria d'animals i oferint un mitjà per a mantenir la diversitat genètica mitjançant l'emmagatzematge d'important germoplasma que podria revitalitzar les poblacions futures. Aconseguir un mètode robust de crioconservació garantiria la preservació del material genètic femení d'espècies en perill d'extinció i de gran importància econòmica. La vitificació és la tècnica més prometedora per a la crioconservació d'oòcits. Des dels primers intents de vitrificació d'oòcits bovins, el protocol de vitrificació i els dispositius de suport utilitzats han canviat considerablement. No obstant això, a causa de les peculiaritats de l'oòcit boví, la taxa de fecundació i la capacitat de desenvolupament dels oòcits crioconservats bovins encara han de millorar-se. Durant el procés de vitrificació, les cèl·lules sofreixen crio-dany i formació de gel, la qual cosa condueix a canvis ultraestructurals que provoquen fallades en la maduració i el desenvolupament. Per a aquest propòsit, en aquesta tesi hem investigat diferents estratègies per a millorar la capacitat de desenvolupament dels oòcits bovins després dels processos de vitrificació i escalfament. Les proteïnes de xoc tèrmic (HSPs) són proteïnes d'estrès cel·lular altament conservades que s'han identificat com un mecanisme de defensa cel·lular. La majoria d'elles s'expressen de forma constitutiva a nivells baixos, però algunes es poden regular positivament en resposta a factors estressants cel·lulars per a controlar el plegament de proteïnes i protegir contra l'agregació i desnaturalització de proteïnes. Entre les proteïnes induïbles, en aquesta tesi van ser analitzades la HSP70 (HSPA1A) i la HSP90 (HSP90AA1). En el capítol II, podem observar com un tractament de xoc tèrmic definit (1h, 41.5 °C) va augmentar la intensitat de la fluorescència per a la HSP70 quan es va aplicar a les 8h d'IVM. Quan aquest estrès per calor es va aplicar abans de la vitificació dels oòcits, no es van mitigar els efectes nocius de la crioconservació, com prèviament hi havia hipotetitzat. El líquid fol·licular és naturalment ric en factors de creixement i citocines. Se sap que la família de citocines interleuquina (IL) -6 té un paper predominant en la funció de reproducció. En el capítol III, avaluem com la IL-6, la IL-11 i el factor inhibidor de la leucèmia (LIF) induïen canvis en l'expressió de miR-21 i uns altres miRNAs claus en cèl·lules de cúmuls i oòcits bovins. No trobem dades prometedores per a IL-6 i IL-11, però LIF va augmentar l'expressió de miR-21tant en cèl·lules de cúmul com en oòcits. S'ha descrit el paper del LIF en l'activació de vies de senyalització clau per a la supervivència i el manteniment de les cèl·lules. En el capítol IV, avaluem com la suplementació amb LIF afectava el desenvolupament d'embrions i modulava l'expressió gènica en oòcits i embrions. LIF va augmentar l'expressió d'HSPA1A i HSP90AA1 en el moment de l'activació del genoma embrionari. En el moment en què es van desenvolupar els embrions, en l'etapa expandida i eclosionada, la HSPA1A es va reduir i també ho va fer el DNMT3A. LIF no va influir en la divisió i la taxa de blastocists. El major impacte exercit per LIF va ser durant la transició matern-embrionària. Imitant les condicions fisiològiques i guiats pels resultats obtinguts anteriorment, en el capítol V suplementaren els oòcits amb LIF durant la maduració per a millorar la vitrificació. La vitrificació va modificar clarament els nivells de ARNm i el LIF sembla precondicionar als oòcits perquè no sofreixin tant estrès, encara que no es van observar diferències en cap grup de tractament en termes de taxa de blastocists.

Gamete cryopreservation, as many other reproductive technologies, has become a necessity for an efficient production of domestic animals, allowing the modification of animal breeding programs and offering a mean to maintain genetic diversity by banking important germplasm that could reinvigorate future populations. Achieving a robust cryopreservation method would guarantee the preservation of feminine genetic material of endangered species and of those of a great economic importance. Vitification is the most promising technique for oocyte cryopreservation. From the first attempts of vitrifiying bovine oocytes the vitrification protocol and the support devices used have changed considerably. However, due to the peculiarities of the bovine oocyte, fertilization rate and developmental competence of bovine cryopreserved oocytes still need to be improved. During the vitrification process cells suffer cryodamage and ice formation, what leads to ultrastructural changes driving to maturation or development impairment. For this purpose, in this thesis we have investigated different strategies to ameliorate the developmental competence of bovine oocytes after vitrification and warming processes. Heat shock proteins (HSPs) are highly conserved cellular stress proteins that have been identified as a cell defense mechanism. Most of them are constitutively expressed at low levels but some can be upregulated in response to cellular stressors so to regulate protein folding, protect against protein aggregation and denaturation. Among the inducible ones, HSP70 (HSPA1A) and HSP90 (HSP90AA1) were those analyzed in this thesis. In chapter II, we can observe how a defined heat shock treatment (1h, 41.5ºC) increases fluorescence intensity for HSP70 when applied at 8h of IVM. When this heat stress was applied before oocyte vitification, it did not mitigate the harmful effects of cryopreservation how me hypothesized. Follicular fluid is naturally rich in growth factors and cytokines. Interleukin (IL)-6 family of cytokines is known to have a predominant role in reproduction function. In chapter III, we assessed how IL-6, IL-11 and leukemia inhibitory factor (LIF) induced changes in the expression of miR-21 and other key miRNAs in bovine cumulus cells and oocyte. We did not find promising data for IL-6 and IL-11, but LIF did enhance the expression of miR-21 in both cumulus cells and oocytes. LIF has been described to activate key signaling pathways for cell survival and maintenance. In chapter IV, we evaluated how LIF supplementation affected embryo development and modulated gene expression in oocytes and embryos. LIF increased expression of HSPA1A and HSP90AA1 at the time of embryonic genome activation. By the time embryos developed, at the expanded and hatched stage, HSPA1A was reduced and so did DNMT3A. LIF did not influence on cleavage and blastocyst rate. The greater impact exerted by LIF was during the maternal-to-embryonic transition. Mimicking physiological conditions, and guided for the results obtained previously, on chapter V we supplemented oocytes with LIF during maturation in order to improve vitrification. Vitrification modifies clearly mRNA levels and LIF seemed to precondition oocytes not to suffer so much stress, although no differences were observed in any treatment group in terms of blastocyst rate.