Nuevas estrategias terapéuticas para limitar el desarrollo del aneurisma de aorta abdominal: inhibición del estrés del retículo endoplasmático y mitocondrial

Abstract

Introducción: el aneurisma de aorta abdominal (AAA) es una enfermedad vascular degenerativa caracterizada por una dilatación de la aorta abdominal del 50% o mayor que el diámetro normal. Presenta una prevalencia del 4-8 % en hombres mayores de 65 años y está asociada a una alta morbilidad y mortalidad. Es una enfermedad con una etiopatogenia muy compleja y se cree causada por una combinación de múltiples factores de riesgo entre los que se incluye el tabaquismo, edad avanzada, hipertensión, aterosclerosis y tener antecedentes familiares. Objetivo: actualmente no existen terapias efectivas para frenar el desarrollo del AAA y su tratamiento se limita a la reparación quirúrgica. En la literatura se ha descrito la contribución de la activación del estrés del retículo endoplasmático (RE) y su relación con la disfunción mitocondrial con la fisiopatología de diversas enfermedades cardiovasculares. Nuestro objetivo es dilucidar la posible implicación del estrés del RE en el desarrollo del AAA a través del estudio de muestras de aortas aneurismáticas procedentes de una cohorte de pacientes y determinar la eficacia de la inhibición del estrés del RE para limitar la degeneración vascular en el AAA. Materiales y métodos: la expresión de marcadores del estrés del RE, del estrés mitocondrial y de fenómenos de autofagia y apoptosis se analizó mediante PCR a tiempo real, western-blot e inmunotinción en muestras humanas de AAA. La cuantificación de oxisteroles en plasma se realizó por cromatrografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-(APCI)-MS/MS) y los niveles de S100A4 y Gdf15 se cuantificaron mediante kits de ELISA. Las características de la pared vascular se estudiaron mediante técnicas de histología clásica y el infiltrado inflamatorio se estudió mediante inmunohistoquímica en la aorta abdominal en nuestra cohorte pacientes y donantes y en el modelo murino de AAA (deficiente en apolipoproteínaE infundido con angiotensina II) utilizado en nuestro estudio. En este modelo se evaluó el efecto de la administración de inhibidores del estrés del RE, fenilbutirato sódico (PBA) y ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA), sobre el diámetro aórtico en los días 0, 3, 7, 14, 21 y 28 de la infusión con Ang II mediante ultrasonografía y sobre la presión arterial (método del manguito en la cola). La expresión de marcadores del estrés del RE, de apoptosis y de inflamación y de las metaloproteinasas (MMPs) 2 y 9 se cuantificó mediante PCR a tiempo real y en el caso de las MMPs se realizaron ensayos de zimografía clásica para determinar su actividad gelatinolítica en la aorta abdominal de ratones. Resultados: en pacientes con AAA y en la aorta abdominal del ratón ApoE-/- infundido con Ang II se confirmó el aumento de la expresión génica y proteica de diferentes marcadores del estrés del RE acompañado de una exacerbación del estrés oxidativo, un descenso en la expresión de indicadores de la biogénesis mitocondrial y un incremento en la apoptosis en la pared vascular. En plasma, el perfil de oxisteroles y los niveles de S100A4 y Gdf15 se encontraron alterados en pacientes respecto a donantes. La administración de PBA y TUDCA redujo la incidencia de AAA disminuyendo la dilatación aórtica y la desestructuración de la pared vascular y redujo significativamente la presión arterial. La sobre-expresión de los marcadores de estrés del RE, de inflamación y de metaloproteinasas en la aorta abdominal de animales disminuyó con el tratamiento con PBA y TUDCA de manera diferencial. Conclusiones: Nuestros resultados evidencian la activación de estrés del RE en el AAA humano y sugieren que su inhibición podría constituir una estrategia terapéutica para limitar del desarrollo de esta enfermedad.

Introduction: the abdominal aortic aneurysm (AAA) is a degenerative vascular disease characterized by a dilatation of the abdominal aorta of 50% or greater than the normal diameter. It has a prevalence of 4-8% in men older than 65 years and it is associated with a high morbidity and mortality. It is a very complex disease and is believed to be caused by a combination of multiple risk factors: smoking, advanced age, hypertension, atherosclerosis and a family history.

Objective: Currently there are no effective therapies to stop the development of AAA and its treatment is limited to surgical repair. The contribution of stress activation of the endoplasmic reticulum (ER) and its relationship with mitochondrial dysfunction to the pathophysiology of several cardiovascular diseases has been previously described. Our objective is to evaluate the possible implication of ER stress in the development of AAA and to test the efficacy of ER stress inhibition to limit vascular degeneration in AAA disease. Materials and methods: the expression of ER stress markers, mitochondrial stress and apoptosis and autophagy markers was analyzed by real-time PCR, western-blot and immunostaining in human AAA samples. The quantification of oxysterols in plasma was performed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC- (APCI) -MS / MS) and the circulating levels of S100A4 and Gdf15 were quantified with ELISA kits. The structure of the vascular wall was studied by classical histology techniques and the inflammatory infiltrate was studied by immunohistochemistry in the abdominal aorta of our patients and donors cohort and in the abdominal aorta of our murine model of AAA (mice deficient in apolipoprotein E infused with angiotensin II). In this model we evaluated the effect of the administration of ER stress inhibitors, sodium phenylbutyrate (PBA) and tauroursodeoxicolic acid (TUDCA), on the aortic diameter on days 0, 3, 7, 14, 21 and 28 by ultrasonography during the time of infusion with Ang II and the effect on blood pressure (tail cuff method). The expression of ER stress markers, apoptosis, inflammatory markers and metalloproteinases (MMPs) 2 and 9 was quantified by real-time PCR and in the case of MMPs, zymography tests were performed to determine its gelatinolytic activity in the protein lysates of abdominal aortas from mice.

Results: in aneurismatic wall of patients with AAA and in the abdominal aorta of the ApoE-/- mouse infused with Ang II, an increase of the gene and protein expression of different ER stress markers was confirmed. This was accompanied by an exacerbation of oxidative stress, a decrease in the expression of indicators of mitochondrial biogenesis and by an increase in apoptosis in the vascular wall. In plasma, the profile of oxysterols and the levels of S100A4 and Gdf15 were found to be altered in patients vs. donors. In animals, the administration of PBA and TUDCA reduced the incidence of AAA by decreasing aortic dilatation and the disorganization of the vascular wall and by reducing blood pressure. The expression of ER stress markers, inflammatory markers and matrix metalloproteinases in the abdominal aorta of mice decreased with either the treatment with TUDCA or PBA.

Conclusions: our results evidence that ER stress is involved in the pathophysiology of aneurysm and show that inhibition of ER stress is effective to limit abdominal aortic dilatation in AAA disease.