Caracterització morfològica i molecular i estudi epidemiològic d’espècies d’Anisakis i Hysterothylacium (Nematoda: Ascaridoidea) en peixos de consum habitual procedents de l’Atlàntic Nord-Est i del Mediterrani

Abstract

Aquest treball engloba l’estudi d’espècies de nematodes ascaridoïdeus de les famílies Anisakidae i Raphidascarididae paràsites de peixos marins arreu del món que presenten un interès sanitari i/o comercial. Dins la família Anisakidae, les espècies del gènere Anisakis són les principals causants de l’anisakiosi en humans pel consum de peix cru o insuficientment cuinat parasitat amb larves; malaltia alimentària considerada com emergent, la qual pot cursar amb símptomes gastrointestinals i/o al·lèrgics. El gènere Hysterothylacium de la família Raphidascarididae comprèn espècies que, tot i ser considerades no patògenes, s’han associat a reaccions al·lèrgiques. Les espècies d’aquests gèneres parasiten en la seva forma larvària un gran ventall de peixos, que actuen com a hostes paratènics o de transport del paràsit, amb una elevada prevalença i abundància. La identificació específica és complexa, amb l’existència d’espècies bessones morfològicament indiferenciables en Anisakis i de morfotips larvaris idèntics amb diferents genotips en Hysterothylacium. L’objectiu general del present treball ha estat caracteritzar i identificar morfològicament i molecular les espècies d’Anisakis i Hysterothylacium detectades en peixos de consum habitual en el nostre entorn, el sorell (Trachurus trachurus), la maire (Micromesistius poutassou) i el seitó (Engraulis encrasicolus), així com estudiar els factors epidemiològics que afecten el grau de parasitació. Puntualment, també s’ha volgut identificar les larves d’Anisakis causants de casos clínics d’anisakiosi, donat que a Espanya no s’havia realitzat cap diagnosi específica en casos documentats.

En el present treball s’han estudiat peixos adquirits en comerços de Barcelona, de les espècies anteriorment esmentades procedents de l’Atlàntic Nord-est, el Mediterrani Oest i el mar Adriàtic. De les 2621 larves detectades, la majoria han estat identificades com a larves de tercer estadi (L3) d’A. simplex sensu lato, i en menor proporció a L3 d’H. aduncum, observades a totes les espècies d’hostes i àrees estudiades. També s’han identificat larves de quart estadi (L4) d’H. fabri al Mediterrani Oest, majoritàriament en el sorell, i puntualment larves L3 d’A. physeteris en peixos del Mediterrani principalment.

L’estudi epidemiològic de les espècies de nematodes ascardoïdeus detectades, ha mostrat que l’origen geogràfic és el factor més influent en la seva abundància, presentant els hostes de l’Atlàntic les prevalences més elevades, entre un 79,5 i un 100% per A. simplex (s.l.) i un 63 i 68% per H. aduncum, i unes abundàncies al voltant de 30 i 5 per a larves A. simplex (s.l.) i H. aduncum respectivament. Les dues espècies també s’han detectat amb elevada freqüència a la musculatura de la maire de l’Atlàntic amb el mateix patró de distribució, essent la porció més parasitada la musculatura anteroventral o ventresca.

A. simplex sensu stricto i A. pegreffii són espècies bessones incloses dins del complex A. simplex (s.l.), de difícil diferenciació a nivell larvari si no es recorre a metodologies moleculars. L’anàlisi molecular, utilitzant la PCR-RFLP de la regió ITS de l’ADNr, ha permès la identificació d’A. simplex (s.s.) en hostes de l’Atlàntic, d’A. pegreffii en tots els hostes i àrees estudiades i d’alguns exemplars amb genotip híbrid entre les dues espècies. La seqüenciació de la regió EF1 α−1 de l’ADNn d’aquests híbrids ha permès comprovar que la regió ITS sobreestima el nombre d’exemplars identificats per PCR-RFLP, en el nostre cas reduint-lo en aproximadament un terç. Un exemplar híbrid s’ha identificat per primer cop al Mediterrani Oest, considerada com una zona al·lopàtrica, essent detectats la resta a la zona simpàtrica de l’Atlàntic Nord-est.

L’anàlisi discriminant morfomètrica realitzada ha permès la diferenciació entre els estadis larvaris de les espècies bessones A. simplex (s.s.) i A. pegreffii. De les dues espècies es van estudiar larves L3 provinents de peixos i larves L4 obtingudes in vitro, optimitzant les condicions de cultiu. Mitjançant l’anàlisi estadística per regressió logística binària es van trobar dues funcions, per a L3 i L4, constituïdes per tres i quatre caràcters morfològics respectivament. Les mesures relacionades amb el ventricle poden ser considerades com a variables clau, ja que estan incloses en ambdues funcions. L’anàlisi morfomètrica va permetre la discriminació de les larves L3 i L4 de les dues espècies en un 78 i 83% dels casos respectivament, sense mostrar diferències estadístiques respecte a la identificació molecular.

Respecte a les espècies d’Hysterothylacium, algunes poden presentar la mateixa morfologia larvària, per tant, és important la correcta classificació de larves en morfotips, així com la identificació dels seus genotips. L’estudi de larves L3 aïllades dels peixos i de larves L4 i adults d’H. aduncum obtinguts per cultiu in vitro optimitzat, ha permès la caracterització dels morfotips larvaris i del genotip d’aquesta espècie. Dels 18 morfotips larvaris d’espècies d’Hysterothylacium descrits fins al moment arreu del món, les larves L3 i L4 d’H. aduncum detectades a les tres zones estudiades corresponen als morfotips VIII i IX respectivament. La seqüenciació de la regió ITS ha permès la identificació d’un genotip en aquesta espècie, detectat per primera vegada en aquests morfotips. Pel que fa a H. fabri, les larves L3 i L4 detectades corresponen als morfotips III i IV respectivament, compartint el mateix genotip, també descrit per primera vegada.

Finalment, l’agent causal de dos casos d’anisakiosi a Barcelona s’ha identificat específicament com a A. simplex (s.s.) per PCR-RFLP i seqüenciació. Es tracta de la primera caracterització molecular de larves d’Anisakis en un cas clínic a Espanya. La diagnosi específica de l’anisakiosi és important per entendre si les diferències en patologia estan relacionades amb l’espècie.

This study is focused on Anisakis and Hysterothylacium species, ascaridoid nematode parasites of marine fish worldwide presenting sanitary and commercial interest. Species of Anisakis are the main causative agents of anisakiasis, an emerging disease transmitted by the consumption of raw or undercooked fish parasitized with larvae, which can cause gastrointestinal and/or allergic symptoms. The main objective of this work was to identify morphologically and molecularly the species detected in three commonly consumed fish in Spain, horse mackerel, blue whiting and anchovy, caught in the North-East Atlantic and the Mediterranean, as well as to study the main epidemiological factors influencing the degree of parasitation.

Detected larvae in fish corresponded mostly to third stage larvae (L3) of A. simplex sensu lato and H. aduncum, both species being observed in all hosts and areas studied. Fourth stage larvae (L4) of H. fabri, in Mediterranean horse mackerel, and a few L3 larvae of A. physeteris were also identified. Geographical origin was detected as the most influential factor in the abundance of nematode parasites, which was higher in Atlantic hosts for A. simplex (s.l.) and H. aduncum. Both species were widely detected, with the same distribution pattern, in the musculature of Atlantic blue whiting, the belly flaps being the most parasitized portion. Molecular analysis of the ITS region by PCR RFLP identified the sibling species A. simplex (s.s.) in Atlantic hosts and A. pegreffii in all hosts and areas studied. Specimens with a hybrid genotype between both species were also identified and confirmed by sequencing of the EF1 α-1 gene as a second molecular marker. For the first time, a hybrid specimen was identified in the West Mediterranean, which is considered an allopatric area.

The sibling species A. simplex (s.s.) and A. pegreffii were differentiated by a morphometric analysis, using binary logistic regression, obtaining two discriminant functions, for L3 and L4 respectively, which included three and four parameters, respectively; measurements of the ventricle were considered as key variables. The morphometric discrimination showed no significant differences from the molecular identification. The larvae of H. fabri and the larvae and experimental adults obtained in vitro of H. aduncum were subjected to a morphotype and genotype analysis. L3 and L4 of H. fabri corresponded to morphotypes III and IV, respectively, from the 18 Hysterotylacium morphotypes described; while L3 and L4 of H. aduncum corresponded to morphotypes VIII and IX, respectively. Sequencing of the ITS region permitted the identification for the first time of genotypes found in both morphotypes of each species.

The causative agent of two anisakiasis cases in Barcelona was molecularly identified as A. simplex (s.s.), being the first specific identification of Anisakis larvae in a Spanish clinical case.