Desarrollo de nuevas aproximaciones para el diagnóstico molecular de los síndromes de predisposición hereditaria al cáncer asociados a deficiencia del sistema de reparación de apareamientos erróneos

Abstract

La función principal del sistema de reparación de apareamientos erróneos (MisMatch Repair, MMR) es corregir los errores principalmente introducidos por las DNA polimerasas durante la replicación del genoma. Las mutaciones germinales deletéreas en alguno de los cuatro genes principales del sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2) son las responsables de los síndromes de predisposición hereditaria a cáncer asociados a deficiencia de este sistema: el síndrome de Lynch (SL), causado por mutaciones monoalélicas en estos genes, y el síndrome de Deficiencia Constitucional de Reparación de Apareamientos Erróneos (CMMRD), causado por mutaciones bialélicas. A consecuencia de la deficiencia de este tipo de reparación, los tumores asociados a estos dos síndromes exhiben pérdida de expresión de las proteínas MMR y/o inestabilidad de microsatélites (MSI) y, aunque en menor grado, estas características también se observan en tejido normal.

El diagnóstico de estos síndromes se basa en la identificación de mutaciones patogénicas en los genes MMR en línea germinal. Sin embargo, el diagnóstico no siempre es posible. La presencia de mutaciones crípticas, la identificación de variantes de significado desconocido (VUS) (que representan el 30% de las variantes que se encuentran en la rutina de diagnóstico) y la existencia de fenotipos intermedios o solapantes con otros síndromes, dificultan el diagnóstico, lo que impacta en el manejo clínico del paciente y sus familiares.

El objetivo de esta tesis doctoral es mejorar el diagnóstico de los síndromes de predisposición hereditaria al cáncer asociados a deficiencia del sistema MMR. Con este objetivo global nos hemos planteado dos objetivos específicos. El primer objetivo es mejorar la evaluación de la patogenicidad de las variantes aplicando modelos multifactoriales, que integran múltiples líneas de evidencias tanto cualitativas como cuantitativas. También se ha estandarizado el ensayo in vitro de actividad reparadora, dirigido a testar la función más importante de una proteína MMR, con el fin de que pueda ser utilizado en la determinación de la patogenicidad de una VUS. El segundo objetivo es desarrollar una nueva metodología, basada en la detección con alta sensibilidad de la MSI en los tejidos normales de los portadores de mutaciones MMR, para poder diagnosticar de estos síndromes a pesar de no encontrar mutación o de la presencia de VUS.

En relación al primer objetivo, se han reclasificado a patogénicas o benignas el 89% de las variantes estudiadas en esta tesis doctoral gracias a la integración del cálculo multifactorial de probabilidad, la frecuencia poblacional, las predicciones in silico y los ensayos funcionales a nivel de RNA y proteína en un nuevo algoritmo de clasificación, lo que apoya su utilidad. Además, el ensayo in vitro de actividad reparadora ha sido optimizado a nivel de reactivos y validado a nivel analítico demostrando robustez y reproducibilidad. A destacar, se han establecido protocolos estándar para su realización, lo que representa el primer paso para su implementación en el diagnóstico

En cuanto al segundo objetivo, la metodología desarrollada para la detección con alta sensibilidad de la MSI en sangre periférica discrimina con una sensibilidad y especificidad del 100% a los pacientes CMMRD del resto de grupos (pacientes SL y de otros síndromes con fenotipo solapante), aunque no ha demostrado suficiente sensibilidad para detectar MSI en los pacientes SL. Esta herramienta, por lo tanto, podría ser especialmente útil para el diagnóstico de CMMRD, sobre todo en los casos con ausencia de mutaciones patogénicas identificadas en los genes MMR. Será necesario testar otros tejidos, como la mucosa colónica normal, para profundizar en la dinámica de MSI en tejidos diana de pacientes afectos de SL antes del desarrollo de la neoplasia.

El trabajo realizado en esta tesis doctoral representa una mejora de las actuales estrategias para el diagnóstico molecular de los síndromes de síndromes de predisposición hereditaria al cáncer asociados a deficiencia del sistema MMR.