Metabolismo de esteroles esterificados en plantas: implicación en el desarrollo y la respuesta a estrés

Abstract

Los esteroles son una familia de compuestos triterpénicos que se presentan en forma libre o conjugada, como ésteres, glicósidos y acilglicósidos de esteroles. Cada especie vegetal tiene su propio perfil cualitativo y cuantitativo de esteroles libres y conjugados, aunque en las distintas fracciones el β-sitoesterol, el estigmasterol y el campesterol son los esteroles más abundantes. Los esteroles libres y sus derivados glicosilados se localizan en las membranas celulares, principalmente en la membrana plasmática, donde actúan como componentes estructurales que contribuyen a mantener la fluidez y la permeabilidad de las mismas. Por otra parte, los esteroles esterificados se acumulan en cuerpos lipídicos citoplasmáticos, constituyendo una reserva de esteroles que se almacena o se moviliza en función de las necesidades celulares (exceso o defecto) de esteroles libres y glicosilados en las membranas celulares. La esterificación de los esteroles está mediada por las esterol aciltransferasas, enzimas que desempeñan un papel muy relevante en el mantenimiento de la homeostasis de los esteroles en las membranas celulares. Hay evidencias que indican que los niveles de los esteroles esterificados experimentan cambios importantes durante la senescencia de los tejidos vegetales y cuando las plantas se enfrentan a situaciones de estrés. Sin embargo, el conocimiento acerca de las esterol aciltransferasas de plantas es todavía limitado. Hasta hace muy poco tiempo sólo se habían clonado y caracterizado dos esterol aciltransferasas de Arabidopsis: una fosfolípido:esterol aciltransferasa (PSAT1) y una acil CoA:esterol aciltransferasa (ASAT1). Recientemente, en una tesis doctoral previa de nuestro grupo de investigación se identificaron y comenzaron a caracterizar las enzimas ASAT1 y PSAT1 de tomate (SlASAT1 y SlPSAT1). A partir de estos antecedentes, en este trabajo de Tesis Doctoral se ha seguido avanzando en el estudio de la función biológica de las esterol aciltransferasas de plantas ASAT1 y PSAT1, empleando Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (cv Micro-Tom), prestando especial atención al estudio de su función y la de los esteroles esterificados en el crecimiento, desarrollo y la respuesta frente al estrés. Los resultados obtenidos mediante complementación funcional de los mutantes asat1-1 y psat1-2 de Arabidopsis con las proteínas SlPSAT1 y SlASAT1 han confirmado la diferente capacidad de estas proteínas para esterificar esteroles mayoritarios finales e intermediarios, respectivamente. Además, en semillas y hojas de los mutantes de tomate con la enzima SlPSAT1 inactivada (CR-psat1) obtenidas mediante el sistema de edición génica CRISPR/Cas9, se observa una reducción muy marcada del contenido de esteroles esterificados que se correlaciona con un incremento en los niveles de esteroles libres y en el caso de las hojas, con una clara disminución del número de cuerpos lipídicos, en comparación con lo observado en plantas wild type. Sin embargo, estos cambios no se producen en las líneas de tomate que tienen inactivada la enzima SlASAT1 (CR-asat1). Estos resultados apoyan la idea de que, tal y como se ha propuesto en Arabidopsis, la SlPSAT1 participa de forma más activa que la SlASAT1 en la síntesis de esteroles esterificados y en la homeostasis de esteroles libres. La pérdida de función de SlASAT1 produce un ligero retraso en el inicio de la germinación sin que se afecte la tasa final de la misma. Sin embargo, la inactivación de SlPSAT1 afecta a ambos parámetros e induce un fenómeno de germinación atípica, en el que se observa la aparición de los cotiledones previa a la de las radículas, con las consiguientes anomalías en el establecimiento de las plántulas. Las líneas CR-psat1 presentan también un fenotipo de enanismo moderado y alteraciones en la morfología de las hojas. Por otra parte, la reducción del contenido de esteroles esterificados en Arabidopsis se traduce en mayor sensibilidad a la infección con Pseudomonas syringae, ya que el mutante psat1-2, pero no el asat1-1, es más sensible a la bacteria que las plantas wild type. En tomate la pérdida de función de PSAT1 parece incrementar la sensibilidad a estrés salino, ya que el crecimiento de los mutantes CR-psat1 en presencia de concentraciones elevadas de NaCl es menor que el de las plantas wild type, un efecto que no se observa en los mutantes CR-asat1. En conjunto los resultados de este trabajo sugieren que los esteroles esterificados y SlPSAT1 desempeñan un papel importante tanto en el desarrollo y crecimiento de las plantas como en la respuesta a diferentes tipos de estrés, y establecen las bases para estudios posteriores dedicados a comprender el mecanismo de acción de los esteroles esterificados y las esterol aciltransferasas en estos procesos fisiológicos.

Sterols are a family of triterpenoid compounds that occur as free form or conjugated like steryl esters, steryl glycosides and acylated steryl glycosides. Each plant species has its own qualitative and quantitative profile of free and conjugated sterols, although the most abundant sterols in the different fractions are β-sitoesterol, stigmasterol and campesterol. Free sterols and their glycosylated derivatives are localized in cell membranes, mainly in the plasma membrane, where they act as key structural components involved in maintaining membrane fluidity and permeability. On the contrary, steryl esters accumulate in cytoplasmic lipid droplets, where they served as a reservoir of sterols that can be stored or mobilized depending on the cellular needs (excess or shortage) of free and glycosylated sterols in cell membranes. The synthesis of steryl esters is catalyzed by sterol acyltransferases that are essencial players in maintaining sterol homeostasis in cell membranes. There is ample evidence that steryl esters levels undergo significant changes during plant tissues senescence and when plants face different type of stress, in spite of which the current knowledge about sterol acyltransferases in plants is still limited. Until very recently, two Arabidopsis sterol acyltransferases where the only plant sterol acyltransferases cloned and characterized, phospholipid:sterol acyltransferase (PSAT1) and acyl-CoA:sterol acyltransferase (ASAT1). Recently, in a previous work carried out in our research group, the tomato enzymes ASAT1 and PSAT1 (SlASAT1 and SlPSAT1) where indetified, cloned and preliminary characterized. Using this knowledge as background, in this PhD Thesis project, progress has been made in the study of the biological function of the plant sterol acyltransferases ASAT1 and PSAT1 using Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum (cv Micro-Tom), paying special attention to the study of their function, and the role of steryl esters in plant growth, development and response to stress. The results obtained by functional complementation of the Arabidopsis asat1-1 and psat1-2 mutants with SlPSAT1 and SlASAT1 have confirmed the different ability of these enzymes to esterify sterol end products and sterol precursors, respectively. Besides, in seeds and leaves of mutants with inactive SlPSAT1 (CR-psat1) generated using CRISPR/Cas9 genome editing system, there is a strong reduction in the content of steryl esters that correlates with a moderate increase in free sterol levels, while in leaves theres is also a decrease of the number of lipid droplets compared to the one observed in wild type leaves. These changes did not occur in the tomato mutant lines with inactive SlASAT1 (CR-asat1). Altogether these results provide further support to the proposal that SlPSAT1 participates more actively than SlASAT1 in the biosynthesis of steryl esters and free sterol homeostasis. Loss of function of SlASAT1 causes a delay of seed germination but has no effect on the final germination percentage. However, the inactivation of SlPSAT1 affects both parameters and induces an atypical germination phenomenon, where cotyledones emerge first than the radical leading to anomalies on seedling establishment. The CR-psat1 lines show also a mild dwarf phenotype and alterations on leaf morphology. Reduces levels of steryl esters in Arabidopsis lead to a higher sensitivity of plants to the infection of Pseudomonas syringae, since the psat1-2 mutant, but not the asat1-1 mutant, is more sensitive to this bacterial pathogen than the wild-type plants. In tomato, loss of function of SlPSAT1 increases the sensitivity to salt stress, because CR-psat1 mutant plants are less toletant to NaCl than wild type plants, an effect that was not observed in the case of CR-asat1 mutants. Altogether, the results obtained from this work suggest that steryl esters and SlPSAT1 play an important role both in plant growth and development and also in plant response to different type of stress. This work set the bases for further studies aimed at a better understanding of the mechanism of action of steryl esters and sterol acyltransferases in these physiological processes.