Using deep mutagenesis to understand genetic and physical interactions

Abstract

The first aim of this thesis was to tackle a core question in biology—to understand how large numbers of mutations combine together to influence phenotypes. In order to do so, we built a combinatorially-complete library of naturally occurring variants in a yeast tRNA. For the first time in any gene, we could quantify the extent of which both the effects of individual mutations and the interactions between pairs of mutations change across a large number of closely-related genotypes. We found that all mutations switch from beneficial to detrimental effects and all interactions switch from positive to negative in different backgrounds. Secondly, with the use of systematic mutagenesis, protein complementation assays and deep sequencing, we developed a new experimental methodology to map the interaction interfaces of physically interacting proteins at amino acid resolution. The approach works by quantifying the effects of mutations on both protein binding and stability, resulting in a high resolution map of an interaction interface.

El primer objectiu d'aquesta tesi va ser abordar una qüestió fonamental en biologia: entendre com la combinació d’un gran nombre de mutacions poden produir canvis en el fenotip. Per tal d’investigar aquest problema, vam construir una col·lecció de totes les variants genètiques observades en l’evolució d’un ARNt del llevat. Per primera vegada en un anàlisi d’un gen complet, vam quantificar com els efectes de les mutacions individuals, així com les interaccions entre parelles de mutacions, canvien el fenotip. Els resultats mostren que en diferent contextos genètics, totes les mutacions poden ser beneficioses o deletèries. De la mateixa manera, les interactions entre parelles de mutacions exageren o atenuen els efectes de les mutacions individuals depenent del context genètic on ocorren. En segon lloc, utilitzant tècniques de mutagènesi sistemàtica, mètodes de complementació de proteïnes i seqüenciació d’ADN, hem desenvolupat una nova metodologia experimental per identificar a resolució d’aminoàcid la interfície de contacte entre dues proteïnes. La metodologia es basa en quantificar els efectes de mutacions que alteren la unió de les dues proteïnes, bé degut a que alteren l’estabilitat d’una d’elles, o bé perquè canvien l’afinitat de l’una per l’altre.