Proteínas relevantes en la homeostasis de metales pesados en el hongo oportunista Fusarium oxysporum

Abstract

Les metal·lotioneïnes (MTs) són proteïnes intracel·lulars de baix pes molecular riques en cisteïnes que tenen una alta capacitat d’unió a metalls pesats. Estudis recents han indicat que les MTs poden tenir un paper significatiu en la virulència de fongs patògens. Actualment, són escassos els estudis relacionats amb aquestes proteïnes en fongs patògens, és per això que el present treball té com a objectiu identificar i caracteritzar proteïnes involucrades en la detoxificació de metalls pesats en Fusarium oxysporum, i determinar la seva contribució en la virulència d’aquesta espècie. Per això es van generar mutants defectius en els gens codificants d’una hipotètica MT (mt1, FOXG_02862) i una hipotètica ATPasa exportadora de coure (crpF, FOXG_03265) presents en el genoma de F. oxysporum. Els estudis d’expressió gènica van demostrar una elevada inducció de la expressió de mt1 en presència de Zn i aquesta predilecció pel Zn es va corroborar mitjançant espectrometria de masses per electrospray (ESI-MS). La presència de Cu, en canvi, va incrementar significativament els nivells d’expressió de crpF, la qual cosa confirma la seva funció com a transportador d’aquest metall. Les soques mutants Δmt1 i ΔcrpF van mostrar menor tolerància al Cd, Cu i Zn, en comparació amb la soca silvestre (wt). La falta de mt1 no va afectar a la capacitat patogènica de F. oxysporum, analitzada en models d’infecció en planta del tomàquet i d’infecció sistèmica en ratolins. No obstant això, la delecció de mt1 va causar una reducció de la resistència a la fagocitosis de macròfags murins. Per una altre banda, la delecció de crpF va augmentar el doble el temps de supervivència mitjà de les plantes infectades respecte a les soques wt. En conclusió, s’han caracteritzat una nova hipotètica metal·lotioneïna (MT1) de Zn en un fong d’importància clínica i fitopatògen, així com una hipotètica exportadora de Cu.

Las metalotioneínas (MTs) son proteínas intracelulares de bajo peso molecular ricas en cisteínas que poseen una elevada capacidad de unión a metales pesados. Estudios recientes han indicado que las MTs pueden tener un papel significativo en la virulencia de hongos patógenos. A día de hoy, son escasos los estudios relacionados con estas proteínas en hongos patógenos, es por ello que el presente trabajo tiene por objetivo identificar y caracterizar proteínas involucradas en la detoxificación de metales pesados en Fusarium oxysporum, y determinar su contribución en la virulencia de esta especie. Para ello se generaron mutantes defectivos en los genes codificantes de una hipotética MT (mt1, FOXG_02862) y una hipotética ATPasa exportadora de cobre (crpF, FOXG_03265) presentes en el genoma de F. oxysporum. Los estudios de expresión génica demostraron una elevada inducción de la expresión de mt1 en presencia de Zn y esta predilección por el Zn se corroboró mediante espectrometría de masas por electrospray (ESI-MS). La presencia de Cu, en cambio, incrementó significativamente los niveles de expresión de crpF, lo cual confirma su función como transportador de dicho metal. Las cepas mutantes Δmt1 y ΔcrpF mostraron menor tolerancia al Cd, Cu y Zn, en comparación a la cepa silvestre (wt). La ausencia de mt1 no afectó a la capacidad patogénica de F. oxysporum, analizada en modelos de infección en planta de tomate y de infección sistémica en ratones. Sin embargo la delección de mt1 causó una reducción de la resistencia a la fagocitosis de macrófagos murinos. Por otro lado, la delección de crpF aumentó el doble el tiempo de supervivencia medio de las plantas infectadas respecto a las cepas wt. En conclusión, se han caracterizado una nueva hipotética metalotioneína (MT1) de Zn en un hongo de importancia clínica y fitopatógeno, así como una hipotética exportadora de Cu.

Metallothioneins (MTs) are intracellular low molecular weight proteins rich in cysteines which possess high metal binding capabilities. Recent studies have shown that MTs could have a significant role in the pathogenic fungi virulence. Nowadays, the studies related to these proteins in pathogenic fungi are few, that is why the present work has the objective to identify and characterize proteins involved in heavy metal detoxification in Fusarium oxysporum, and to determine their contribution to the virulence of this specie. Therefore, knockout mutants were generated in the genes coding for a hypothetical MT (mt1, FOXG_02862) and a hypothetical copper exporter ATPase (crpF, FOXG_03265) which are in the F. oxysporum genome. The expression analysis demonstrated a mt1 high induction in Zn presence and this Zn predilection was corroborated by Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS). The Cu presence, however, increased significantly the crpF expression levels, which confirms its function as copper transporter. The Δmt1 and ΔcrpF strains showed less tolerance to Cd, Cu and Zn, in comparison to the wild type strain (wt). The mt1 lack did not affect the F. oxysporum pathogenic capacity, analysed in infection models in tomato plants and systemic infection in mouse. However, the mt1 deletion caused a reduced resistance to macrophage killing. On the other hand, the crpF deletion increased double the mean survival time of infected plants versus the wt strains. In conclusion, it has been characterized a new hypothetical Zn metallothionein (MT1) in a fungus with clinical relevance and phytopathogen, as a hypothetical Cu exporter.