Biodistribución de bacteriófagos en mamíferos tras terapia fágica oral y emergencia de resistencia bacteriana a los fagos

Abstract

La aplicación terapéutica de bacteriófagos líticos como alternativa a los antimicrobianos tradicionales ha resurgido en los últimos años. Sin embargo, existen algunos aspectos asociados a la terapia fágica que necesitan estudiarse con más profundidad para permitir su definitiva implementación. El presente trabajo se centra en el estudio de dos aspectos de especial relevancia: i) la emergencia de la resistencia a los bacteriófagos en diferentes condiciones de aplicación y ii) la biodistribución y transcitosis de bacteriófagos encapsulados en liposomas tras su administración por vía oral en un modelo murino. Para el estudio de la emergencia de la resistencia bacteriana a bacteriófagos se utilizó el modelo de Salmonella/cóctel de bacteriófagos integrado por UAB_Phi20, UAB_Phi78 y UAB_Phi87, cuyos receptores se localizaban en el LPS. Se evidenció que la emergencia de resistencia difería en función del ámbito de aplicación. Así, el 92 % de los aislados de cultivos in vitro de S. Typhimurium infectados con el cóctel de bacteriófagos fueron resistentes a los 3 fagos, siendo la causa probable de la resistencia la pérdida de la proteína RfaJ, implicada en la síntesis del LPS. Análogamente, en lonchas de jamón cocido contaminadas con S. Typhimurium y tratadas con el cóctel fágico, el 1,4 % de los aislados fueron resistentes a los tres fagos, mostrando también una mutación en el gen rfaJ; mientras que el 1,8 % sólo presentó resistencia a los fagos UAB_Phi20 y UAB_Phi78, debido a cambios en el gen rfc, el cual codifica la polimerasa del antígeno O. Finalmente, en los estudios de terapia fágica en el modelo de pollo de engorde, no se encontró ningún clon resistente al fago UAB_Phi78 aislado de animales contaminados con S. Typhimurium y tratados con el cóctel. Sin embargo, el 8,5 % de los aislados del grupo control fueron resistentes a los tres fagos, no habiéndose podido determinar la causa de dicha resistencia. Por otro lado, el 1,3 % y el 3,3 % de los clones de los animales del grupo control y tratamiento, respectivamente, mostraron resistencia al bacteriófago UAB_Phi78, el cual ejerció un efecto bactericida, pero no bacteriolítico y sin producción de progenie fágica y resistencia asociada a UAB_Phi87. Aunque la causa de dicha resistencia no se ha podido identificar, todo sugiere la implicación de un mecanismo basado en una infección abortiva. En conclusión, este estudio revela que tanto la frecuencia de la emergencia de resistencia como los mecanismos causantes de la misma son diferentes in vitro, en alimentos e in vivo. Además, demuestra la necesidad de abordar los estudios de resistencia de un modo más amplio y de utilizar cócteles que contengan bacteriófagos que reconozcan diferentes receptores para disminuir el desarrollo de resistencias. En el estudio de biodistribución, se administró oralmente el fago UAB_Phi20 encapsulado en liposomas y marcado con el fluorocromo VTS-750 a ratones y visualizándolos mediante el sistema IVIS Spectrum. Esta metodología combinada con métodos de cultivo ex vivo, demostró que la encapsulación daba lugar a un aumento significativo de fagos encapsulados en el estómago 6 h después de su administración. Igualmente, los bacteriófagos encapsulados en liposomas también se encontraron en el bazo, hígado y músculo. Por otro lado, la aplicación de CLSM en cultivos in vitro de células intestinales humanas (Caco-2/HT29/Raji-B) reveló que los liposomas se adhieren a las membranas de dichas células pudiendo permanecer en su interior. En cambio, los bacteriófagos no encapsulados son capaces de translocar la barrera intestinal. Así, la prolongada persistencia de los fagos encapsulados en el estómago y su adherencia a la membrana intestinal podría explicar la mayor eficacia en el tiempo de la terapia fágica oral empleando bacteriófagos encapsulados en liposomas.

Interest in the therapeutic application of virulent bacteriophages as an alternative to traditional antimicrobials has re-emerged in recent years. However, more detailed studies of several aspects associated with phage therapy are needed to allow its definitive implementation. The aim of the research presented in this dissertation was to study i) the emergence of resistance to bacteriophages under different conditions of their application and ii) the biodistribution and transcytosis of liposome-encapsulated bacteriophages after oral administration in a murine model. The study of bacteriophage resistance made use of the model Salmonella/bacteriophage cocktail composed of the phages UAB_Phi20, UAB_Phi78, and UAB_Phi87, whose receptors involving the LPS. The results showed that the emergence of resistance differed depending on the scope of the application. Thus, 92 % of the isolates recovered from in vitro cultures of S. Typhimurium infected with the bacteriophage cocktail were resistant to the three bacteriophages. This form of resistance was probably due to the loss of the RfaJ protein, involved in the synthesis of Salmonella LPS. Similarly, in slices of cooked ham contaminated with S. Typhimurium and treated with the phage cocktail, 1.4 % of the clones were resistant to the three bacteriophages, also showing mutations in the rfaJ gene; meanwhile, only 1.8 % of the clones were resistant to UAB_Phi20 and UAB_Phi78 due to changes in the rfc gene, encoding the O-antigen polymerase. Finally, in studies of phage therapy in a broiler chicken model, no resistance to UAB_Phi78 was found in isolates from animals contaminated with S. Typhimurium and treated with the phage cocktail. However, 8.5 % of the isolates in the control group were resistant to the three phages, not having been determined the mechanisms of this resistance. In addition, 1.3 % and 3.3 % of the clones in the animals of the control and treated group, respectively, were resistant to bacteriophage UAB_Phi78, which exerted a bactericidal but not a bacteriolytic effect and did not result in the production of phage progeny, and additionally showed resistance to UAB_Phi87. The cause of this resistance was also unclear but the evidence suggested a mechanism based on an abortive infection. In conclusion, this study showed that both the frequency of the emergence of resistance and the mechanisms involved differ in vitro, in food, and in vivo. It, therefore, demonstrates the need for a broader approach to resistance studies and the use of cocktails containing bacteriophages that by recognizing different host receptors reduce the development of resistance. The biodistribution studies were performed by orally administering to mice the liposome-encapsulated phage UAB_Phi20 labeled with VTS-750 fluorochrome and then visualizing the phages by the IVIS Spectrum methodology. Using this method together with ex vivo cultures, we were able to show that encapsulation resulted in a significant accumulation of encapsulated phages in the mouse stomach, even 6 h after phage administration. Similarly, liposome-encapsulated phages were found in spleen, liver, and muscle. By contrast, in CLSM study of in vitro cultures of human intestinal cells (Caco-2/HT29/Raji-B), liposomes were seen adhered to the cell membrane or embedded in this. However, non-encapsulated bacteriophages were able to translocate across the intestinal barrier. Taken together, these results could explain the greater efficacy over time of oral phage therapy using liposome-encapsulated bacteriophages.