Exosomas urinarios: identificación de biomarcadores de respuesta clínica en la nefritis lúpica

Abstract

Antecedentes Los biomarcadores actuales en la nefritis lúpica (NL) no son lo suficientemente sensibles o específicos para predecir la evolución renal. Datos recientes abalan el uso de los exosomas urinarios como fuente de biomarcadores de origen renal, con especial relevancia en su contenido de miRNAs. Algunos estudios han identificado varios miRNAs asociados con la actividad de la enfermedad y la formación de fibrosis, pero no se han realizado estudios sobre biomarcadores de pronóstico. Métodos Para identificar biomarcadores pronóstico, realizamos una micromatriz de miRNA en exosomas urinarios de pacientes con NL activa, analizando los resultados en función de la respuesta al tratamiento presentada por los pacientes (7 respondedores y 7 no respondedores). Los estudios de validación se realizaron mediante técnica de RT-qPCR en una nueva cohorte de LN (respondedores = 21 y no respondedores = 22). Entre los miRNAs de interés se realizó un estudio comparativo con los niveles séricos así como con una cohorte de pacientes sanos y otra de nefropatías no lúpicas. Posteriormente se realizó hibridación in situ de tejido renal y estudios in vitro para identificar el origen, diana celular y el mecanismo de acción de estos exosomas a nivel renal. Para cada miRNA expresado diferencialmente, los genes diana potenciales fueron predichos a través del estudio de conjuntos de datos de miRNA. Resultados Los pacientes que respondieron a la pauta de tratamiento estándar expresaron niveles significativamente mayores de miR-31-5p, miR-107 y miR-135b-5p en la orina y en tejido renal en comparación con los no respondedores. El miR-135b-5p mostró el mejor valor predictivo para discriminar a los pacientes que respondieron (AUC = 0.783 [intervalo de confianza del 95%, 0.640 - 0.926], al valor de corte > 0.0884 con una sensibilidad del 77.8% y especificidad del 71.4%). La expresión de los miRNAs se localizó principalmente en la estructura tubular, demostrándose, además, una mayor formación de exosomas enriquecidos con miR-31-5p, miR- 107 y miR-135b-5p a nivel de esta estirpe en comparación con la de células endoteliales glomerulares o mesangiales (p < 0,0001). En cuanto a la diana de estos exosomas, su observó una velocidad de internalización de los derivados de orina de pacientes respondedores superior a los de no respondedores tanto a nivel de las células endoteliales glomerulares como mesangiales (p = 0,001 y 0,0002), siendo además superior la capacidad de internalización a nivel de las células mesangiales englobadas (90% frente a 50%, p < 0,0001). El miR-135b-5p demostró capacidad en la inhibición de la proliferación de las células mesangiales (p < 0.01). Además, el análisis de las distintas dianas biológicas pudo demostrar de forma global un papel de estos miRNAs en la modulación de la respuesta inflamatoria, con reducción de los niveles de citoquinas, quimioquinas y moléculas de adhsesión, un cierto efecto en la modulación sobre la angiogénesis, así como una marcada capacidad antifibrosante. El análisis de la vía identificó nueve dianas comunes relevantes para la recuperación renal, una de ellas, HIF-1α, común para los 3 miRNA de interés. Los 3 miRNAs demostraron un efecto modulador sobre la vía del HIF- 1α a través de su inhibición. Conclusiones Los niveles de miR-135b-5p, miR-31-5p y miR-107 son capaces de predecir la respuesta al tratamiento en el momento del brote y evolutivamente en los pacientes afectos de NL, de forma específica. El origen de estos parecería situarse a nivel de las células tubulares mientras que las mesangiales y endoteliales glomerulares se presentarían como las principales efectoras de sus acciones biológicas. HIF-1α fue identificado como diana común de estos 3 miRNAs, ocasionando la presencia de estos miRNAs una supresión a nivel de la expresión de esta vía, considerando clave en la patogénesis de la NL.

Background Current biomarkers in Lupus nephritis (LN) are not sensitive or specific enough to predict renal outcome. Recent data support the use of urinary exosomes as a source of biomarkers of renal origin, with special relevance in their miRNA content. Some studies have identified several miRNAs associated with disease activity and fibrosis formation, but no studies on prognostic biomarkers have been conducted. Methods To identify prognostic biomarkers, we performed a miRNA microarray on urinary exosomes from patients with active LN, analyzing their results according to the response to standard therapy (7 responders and 7 non-responders). Validation studies were performed by RT-qPCR technique in a new LN cohort (responders=21 and non-responders=22). Among the miRNA of interest, a comparative study was conducted with serum levels in the same cohort as well as with a healthy control group and non-lupus nephropathy cohort. Subsequently, in situ renal tissue hybridization and in vitro studies were performed to identify the origin and cell target of these exosomes at renal level and to understand their mechanism of action. For each differentially expressed miRNA, potential target genes were predicted through miRNA-target datasets. Results Responder patients expressed significantly increased levels of miR-31-5p, miR-107 and miR- 135b-5p in urine and renal tissue compared to non-responders. MiR-135b-5p exhibited the best predictive value to discriminate responder patients (AUC= 0.783 [95% confidence interval, 0.640 - 0.926], cut-off > 0.0884 with 77.8% sensitivity and 71.4% specificity). MiRNAs expression was mainly located in the tubular structure, demonstrating, in addition, greater formation on exosomes enriched with miR-31-5p, miR-107 and miR-135b-5p present in this lineage compared to endothelial glomerular and mesangial cells (p < 0.0001). Regarding the target of these exosomes, a faster rate of internalization of responders' urinary-derived exosomes was observed in both endothelial glomerular and mesangial cells (p = 0,001 y 0,0002), and there was greater capacity of internalization on mesangial cells (90% vs. 50%, p < 0.0001). The miR-135b-5p demonstrated ability to inhibit the proliferation of mesangial cells (p < 0.01). In addition, the analysis of the different biological targets demonstrate globally a role of these miRNAs in the modulation of the inflammatory response, with reduction of cytokines, chemokines and adhesion molecules levels, a modulatory effect on angiogenesis, as well as a marked antifibrosing capacity. The pathway analysis identified nine common targets relevant to renal recovery, one of them, HIF-1α, common for the 3 miRNA of interest. The 3 miRNAs demonstrated a modulating effect on the HIF-1α pathway through its inhibition. Conclusions Levels of miR-135b-5p, miR-31-5p and miR-107 are able to predict the response to treatment at the time of the renal flare and during follow-up in patients with NL, specifically. The origin of the exosomes enriched with these miRNAs appears to be at the level of tubular cells while the mesangial and glomerular endothelial cells appear as the main effectors of their biological actions. HIF-1α was identified as the common target of these 3 miRNAs, causing the presence of these miRNAs suppression of the expression levels of this pathway, considered key in the pathogenesis of NL.