New therapeutic strategies targeting dendritic cell-mediated dissemination of enveloped viruses

Abstract

Les cèl·lules dendrítiques (DCs) són clau en la inducció de respostes immunitàries adaptatives gràcies a la seva capacitat de capturar, processar i presentar antígens derivats de patògens als limfòcits T. Tanmateix, aquestes cèl·lules podrien contribuir a la disseminació inicial del VIH-1 a través de la captura i transmissió viral a les cèl·lules T CD4+ diana, un procés conegut com a trans-infecció. Aquest mecanisme es basa en l’expressió del receptor Siglec-1 (CD169), que reconeix gangliòsids sialilats a la membrana viral. Els nivells de Siglec-1 augmenten en DCs estimulades amb interferó-alfa i lipopolisacàrid, factors immuno-activadors presents durant el decurs de la infecció per VIH-1. En aquesta tesi, hem demostrat que l’interferó-alfa secretat per DCs plasmacitoides (pDCs) infectades per VIH-1, així com l’inteferó-alfa autocrí secretat per cèl·lules mieloides en resposta a lipopolisacàrid, augmenten l’expressió de Siglec-1 en DCs. A més, les pDCs provinents de dones secreten quantitats superiors d’interferó-alfa que les d’homes, posant de manifest la rellevància d’estudiar la trans-infecció del VIH-1 en teixits clau per a l’adquisició del virus en dones.

Així, també hem estudiat el paper de Siglec-1 en la transmissió del VIH-1 per part de DCs primàries aïllades directament de teixit cervical, identificant una població de cèl·lules mieloides cervicals que expressen Siglec-1 i capturen partícules de VIH-1 a través d’aquest receptor. Aquesta capacitat augmenta amb l’activació per interferó-alfa. A més, la transmissió del VIH-1 per cèl·lules mieloides del cèrvix es bloqueja de forma eficient amb un anticòs monoclonal dirigit contra Siglec-1. Per tant, hem generat una sèrie de nous anticossos monoclonals contra Siglec-1 amb la capacitat de bloquejar la tans-infecció del VIH-1 per DCs. S’han produït cinc nous clons, que han demostrat tenir una alta afinitat per diferents epítops localitzats a la regió N-terminal de Siglec-1. A més, aquests anticossos bloquegen la captura i trans-infecció del VIH-1 per DCs, de forma que podrien ser un component en estratègies microbicides dirigides contra aquest tipus de transmissió viral cèl·lula-cèl·lula.

A banda del VIH-1, les cèl·lules dendrítiques participen en la patogènesi d’altres virus, com ara els filovirus d’Ebola i Marburg. A diferència del VIH-1, les DCs són permissives a la infecció per filovirus i són dianes primerenques en la patogènesi viral. Els factors cel·lulars implicats en l’entrada de filovirus en aquestes cèl·lules no han estat totalment caracteritzats, però tant Ebola com Marburg són virus embolcallats que incorporen gangliòsids sialilats durant el procés de gemmació viral. A més, els factors que activen l’expressió de Siglec-1 com ara interferó-alfa i lipopolisacàrid s’han trobat durant la infecció pel virus d’Ebola. Per tant, en aquesta tesi hem estudiat el paper de Siglec-1 en l’entrada de filovirus en DCs. Hem trobat que Siglec-1 està implicat en la captura de partícules no infeccioses d’Ebola per part d’aquestes cèl·lules, especialment després de l’activació per interferó-alfa i lipopolisacàrid. A més, les partícules capturades són acumulades en el mateix compartiment cel·lular en què prèviament s’havia detectat el VIH-1. Siglec-1 també facilita l’entrada citoplasmàtica del virus a les DCs, així que hem determinat la capacitat dels nous anticossos monoclonals contra Siglec-1 d’interferir amb aquest procés, i hem vist que aquests bloquegen tant la captura com l’entrada citoplasmàtica de partícules no infeccioses d’Ebola en cèl·lules mieloides activades. En general, l’activitat delsanticossos monoclonals contra Siglec-1 inhibeix l’accés de retrovirus i de filovirus a les cèl·lules mieloides, cosa que indica el seu potencial ús com a agents antivirals d’ampli espectre.

Las células dendríticas (DCs) son clave en la inducción de respestas inmunitarias adaptativas gracias a su capacidad de capturar, procesar y presentar antígenos derivados de patógenos a los linfocitos T. Sin embargo, estas células también podrían contribuir a la diseminación inicial del VIH-1 a través de la captura de partículas virales y de su transmisión a las células T CD4+ diana, un proceso conocido como trans-infección. Este mecanismo se basa en la expresión del receptor Siglec-1 (CD169), que reconoce gangliósidos sialilados en la membrana viral. Los niveles de Siglec-1 aumentan en DCs estimuladas con interferón-alfa (IFN-α) y lipopolisacárido (LPS), factores immuno-activadores presentes durante el curso de la infección por VIH-1. En este trabajo, hemos demostrado que el IFN-α secretado por DCs plasmacitoides (pDCs) infectadas por VIH-1, así como el IFN-α autocrino secretado por células mieloides en respuesta a LPS, aumentan la expresión de Siglec-1 en DCs. Además, las pDCs provenientes de mujeres secretan cantidades superiores de IFN-α que las derivadas de hombres, poniendo de manifiesto la relevancia de estudiar la trans-infección del VIH-1 en tejidos clave para la adquisición del virus en mujeres.

Por lo tanto, también hemos estudiado el papel de Siglec-1 en la transmisión del VIH-1 por parte de DCs primarias aisladas directamente de tejido cervical, identificando una población de DCs cervicales que expresan Siglec-1 y capturan partículas de VIH-1 a través de este receptor. Esta capacidad aumenta con la activación por IFN-α. Además, la transmisión célula-célula del VIH-1 por células mieloides del cérvix se puede bloquear de forma eficiente con un anticuerpo monoclonal (mAb) dirigido contra Siglec-1. Se han producido cinco nuevos clones, que han demostrado tener una alta afinidad por diferentes epítopos localizados en la región N-terminal de Siglec-1. Además, bloquean de forma eficaç la captura y trans-infección del VIH-1 por DCs, de forma que podrían ser un posible componente en estrategias microbicidas dirigidas contra este tipo de transmisión viral célula-célula.

Además del VIH-1, las DCs pueden jugar un papel importante en la patogénesis de otros virus, como los filovirus Ébola y Marburg. A diferencia del VIH-1, las DCs son permisivas a la infección por filovirus y son dianas tempranas en lapatogénesis viral. Los factores celulares implicados en la entrada de filovirus en DCs no han sido totalmente caracterizados, pero tanto Ébola como Marburg son virus envueltos que incorporan gangliósidos sialilados durante el proceso de budding. Además, los factores que activan la expresión de Siglec-1 como IFN-α y LPS se han encontrado durante la infección por el virus de Ébola. Por tanto, en esta tesis hemos estudiado el papel de Siglec-1 en la entrada de filovirus en DCs. Hemos encontrado que Siglec-1 está implicado en la captura de partículas no infecciosas de Ébola (VLPs) por parte de estas células, especialmente tras la activación por IFN-α y LPS. Además, las VLPs capturadas se acumulan en el mismo compartimento en el que previamente se había detectado VIH-1. Siglec-1 también facilita la entrada citoplásmica del virus en las DCs, así que hemos determinado la capacidad de los nuevos mAbs contra Siglec-1 para interferir en este proceso, y hemos visto que dichos mAbs bloquean tanto la captura como la entrada citoplásmica de VLPs de Ébola en células mieloides activadas. En general, la actividad de los mAbs contra Siglec-1 inhibe el acceso de retrovirus y filovirus en las células mieloides, cosa que indica su potencial uso como agentes antivirales de amplio espectro.

Dendritic cells are key inducers of specific adaptive immune responses due to their capacity to capture, process and present pathogen-derived antigens to T lymphocytes. However, they might also contribute to early HIV-1 dissemination by capturing HIV-1 particles and transmitting them to target CD4+ T cells, a process known as trans-infection. This mechanism relies on the expression of Siglec-1 receptor (CD169), which recognizes sialylated gangliosides on the viral membrane. Siglec-1 is potently up-regulated upon dendritic cell stimulation with interferon-alpha and lipopolysaccharide, which are both immune-activating factors present during the course of HIV-1 infection. Here, we demonstrated that interferon-alpha secreted by HIV-1-infected plasmacytoid dendritic cells and autocrine interferon-alpha secreted by myeloid cells in response to lipopolysaccharide up-regulate Siglec-1 on dendritic cells. Importantly, plasmacytoid dendritic cells derived from women secreted higher amounts of interferon-alpha than those derived from men, highlighting the relevance of studying HIV-1 trans-infection in key female tissues for HIV-1 acquisition.

Thus, we next studied the role of Siglec-1 in HIV-1 transmission mediated by primary dendritic cells directly isolated from cervical tissues, identifying a subset of cervical myeloid cells that expressed Siglec-1 and captured HIV-1 particles in a Siglec-1-dependent manner. This capacity was enhanced upon activation with interferon-alpha. Moreover, HIV-1 cell-to-cell transmission mediated by these cells could be efficiently blocked using an anti-Siglec-1 monoclonal antibody, indicating the potential use of antibodies directed against Siglec-1 in prevention of sexually transmitted HIV-1 acquisition in women. Thus, we generated a set of new anti-Siglec-1 monoclonal antibodies with the capacity to block dendritic cell-mediated HIV-1 trans-infection. Five new clones were produced, demonstrating high affinity for different epitopes located in the N-terminal region of Siglec-1 receptor. Moreover, they efficiently blocked HIV-1 capture and trans-infection mediated by dendritic cells, indicating their potential use in microbicidal strategies targeting this type of viral cell-to-cell transmission.

Aside from HIV-1, dendritic cells can play important roles in the pathogenesis of other viruses, including Ebola and Marburg filoviruses. In contrast to HIV-1, dendritic cells are permissive to filoviral infection and act as early targets in viral pathogenesis. The host factors governing filoviral entry into these cells are not fully characterized, but both Ebola and Marburg are enveloped viruses that incorporate sialylated gangliosides during the budding process. Moreover, Siglec-1-activating factors such as interferon-alpha and lipopolysaccharide have been found during Ebola virus disease. Thus, we investigated the role of Siglec-1 in filoviral entry into dendritic cells. We found that Siglec-1-mediated capture of non-infectious Ebola virus-like particles into these cells, especially upon interferon-alpha and lipopolysaccharide activation. Interestingly, captured Ebola virus-like particles accumulated in the same cellular compartment where HIV-1 was previously detected. Siglec-1 also facilitated Ebola cytoplasmic entry into dendritic cells, so we tested the capacity of novel anti-Siglec-1 monoclonal antibodies to interfere with this process. We found that capture and cytoplasmic entry of Ebola virus-like particles into activated myeloid cells was blocked by these novel antibodies. Overall, the activity of anti-Siglec-1 monoclonal antibodies inhibits the access of both retroviruses and filoviruses into myeloid cells and suggests their potential use as broad-spectrum antiviral agents.