The applicability of in vitro models of the intestinal barrier for the risk assessment of engineered nanomaterials used as food additives

Abstract

Los avances en el campo de la nanotecnología han permitido desarrollar una gran diversidad de nanomateriales sintetizados artificialmente (NMs), los cuales presentan nuevas y prometedoras aplicaciones en diversas industrias. Debido a sus exclusivas propiedades, los NMs son utilizados en la comida o envoltorios de comida como mejora de textura, color, sabor, estabilizador, etc. A pesar de sus propiedades innovadoras, existe un aumento en la preocupación sobre si las nanopartículas (NPs) de dióxido de titanio (TiO2) puedan llegar a producir efectos adversos en la salud humana. La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) clasificó el TiO2 como posible carcinógeno humano (grupo 2B) debido a suficientes evidencias científicas indicando que las NPs de TiO2 pueden causar cáncer de pulmón a través de su inhalación. Sin embargo, en el mismo informe no se obtuvo resultados concluyentes respecto a la exposición de dichas NPs por vía oral debido a la falta de ensayos toxicológicos e información. Es por eso que el objetivo de la presente Tesis es estudiar de manera in vitro los efectos, factores y mecanismos biológicos que la exposición a NPs metálicas puedan causar en el epitelio del intestino delgado humano. Para este propósito, se desarrolló por primera vez en nuestro laboratorio un modelo epitelial in vitro que mimetiza el intestino delgado humano. En nuestro primer estudio, se definieron y caracterizaron condiciones de cultivo del ya descrito modelo, Caco- 2/HT29/Raji-B. Según nuestros resultados en los estudios de integridad y permeabilidad, confirmamos que la mejor ratio de células Caco-2 (enterocitos) y HT29 (células calciformes) era 90:10, respectivamente. Paralelamente se detectó la inducción de células presentadoras de antígenos o también conocidas cómo células M, y se propuso un listado de genes cómo marcadores para bio-monitorizar la correcta diferenciación celular y formación de la barrera intestinal in vitro. Finalmente se testó la funcionalidad de nuestro modelo epitelial in vitro exponiéndolo durante 24 h tanto a NPs de TiO2 como de SiO2. Utilizando microscopía laser confocal se demostró que las NPs de TiO2 podrían conllevar efectos adversos en el epitelio intestinal ya que tienen la capacidad de internalizar en las células, llegando incluso, a entrar en contacto con el núcleo celular. Debida a la gran diversidad de NMs que actualmente se pueden sintetizar artificialmente, y a que cada uno de ellos puede presentar propiedades distintas y por ende afectar de forma diferente sobre la salud humana, el segundo objetivo de la presente Tesis fue valorar los efectos de tres formas distintas de TiO2 (nano-esferas, nano-óvalos i nano-filamentos) utilizando el modelo intestinal Caco-2/HT29. Nuestros resultados demostraron que las tres formas de TiO2 son capaces de desestabilizar el epitelio intestinal, cruzar la cubierta de mucosa, e internalizar en las células hasta alcanzar al núcleo celular. Teniendo en cuenta las imágenes obtenidas con microscopía láser confocal, se demostró que tanto las nano-esferas cómo los nano-óvalos traspasan la barrera intestinal intracelularmente mientras que los nano-filamentos lo hacen por vía paracelular. Finalmente, utilizando el ensayo del cometa, detectamos que las tres NPs produjeron un leve pero estadísticamente significativo daño genotóxico general pero no daño genotóxico oxidativo. Por último, el tercer estudio se llevó a cabo en el departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Binghamton (Binghamton, NY, USA) con el propósito de una mención internacional de la presente Tesis. Puesto que la absorción de nutrientes es una de las principales funciones del intestino delgado, en este estudio se evaluó la actividad de tres enzimas digestivas (Fosfatasa Alcalina Intestinal, Aminopeptidasa-N y la bomba de sodio/potasio) tras exponer el modelo Caco-2/HT29-MTX a NPs de TiO2 y SiO2. Con el fin de simular estrictamente las condiciones reales del tracto gastrointestinal humano, las NPs fueron digeridas de manera artificial simulando el proceso de digestión humano (boca, estómago, intestino), y co-cultivadas con bacterias comúnmente encontradas en el primer segmento del intestino delgado humano, el duodeno. Concretamente se utilizaron el comensal grampositivo Lactobacillus rhamnosus GG, conocido por su actividad probiótica, y el oportunista gramnegativo Escherichia coli NCTC 9001. En este estudio se observó que la presencia de ambas bacterias en el modelo in vitro Caco-2/HT29-MTX, disminuía los efectos adversos de las NPs sobre la actividad enzimática del epitelio.

Nano-technological approaches are allowing the development of deliberately engineered nanomaterials (ENMs), presenting promising new applications for many industrial fields. Especially, ENMs possess unique properties and novel uses in food or food packaging materials such as the enhancement of texture, colour, flavour, nutrient stability and food packaging safety. Despite their innovative properties, there is an increasing concern about the possibility that human exposure to TiO2NPs may lead to significant adverse health effects. The International Agency for Research on Cancer (IARC) classified TiO2 as a human carcinogen group 2B because there was enough evidence that nano-TiO2 may cause lung cancer by inhalation. Although oral exposure was also debated by IARC, the final report was inconclusive due to non-existing standardized procedures for nano- TiO2 risk assessment. Due to the potential adverse effects of this ENMs and the lack of information regarding toxicological aspects over the oral exposure, in this Thesis we have carried out in vitro studies on the biological effects of TiO2NPs. For the aforementioned purpose, we set up and characterized, for the first time in our laboratory, an epithelial in vitro model that closely mimics the human small intestine. Thus, in our first study, we defined the best culture conditions for the alreadydescribed model, Caco-2/HT29/Raji-B. From our integrity and permeability findings, we confirmed that the best Caco-2/HT29 cell ratio is 90:10, respectively, as TEER values, paracellular LY permeability and the mucus shed formed correlated well with other studies. We also were able to detect the induction of M-like cells by TEM. Moreover, in order to monitor the proper barrier formation, we proposed a set of genes related to the cell junctional complexes, brush border enzymes, mucus shed components and M-cell markers. Finally, we tested the goodness of our epithelial in vitro model by exposing it to both TiO2NPs and SiO2NPs for 24 h. Our confocal results evidenced the potential adverse effects of TiO2NPs and SiO2NPs on the intestinal epithelium, as NPs internalization and NPs-cell nucleus interaction were observed. Because of the heightened interest in the identification, validation and standardization of the effects associated to exposures to new ENMs, our second study aimed to assess the effects of three different shapes of TiO2NPs (spheres, rods and wires) on the Caco-2/HT29 barrier. Our results demonstrated that the three types of TiO2NPs have the ability to impair the membrane’s integrity, translocate through the mucus shed and internalize in the cells, reaching the nucleus. Taking into account our confocal images results, we hypothesize that due to their shapes, nano-wires are more likely to cross paracellularly, while nano-spheres and nano-rods used intracellular passage to cross the intestinal epithelium. Despite previous evidence that relate the capability of TiO2NPs to produce ROS, we have not detected oxidatively DNA damage. However, and in accordance with the confocal images showing a great amount of NPscell nucleus events, we detected a slight but significant general DNA damage in the barrier’s cells. Finally, the third study was performed under the framework of an international mention carried out in the Biomedical Engineering Department at the Binghamton University (Binghamton, NY, USA). Nutrient absorption is one of the main and most important functions of the small intestine. Thus, to understand and evaluate whether ENPs can trigger physiological potential pathologies, the activity of the intestinal alkaline phosphatase (IAP), aminopeptidase-N (APN) and Na+/K+ ATPase enzymes were measured after exposing the Caco-2/HT29-MTX barrier to TiO2NPs and SiO2NPs for 4 h. Moreover, and in order to further mimic the physiological conditions of a real digestion, the Caco-2/HT29-MTX barrier was exposed to both NPs previously digested and co-cultured with both Escherichia coli and Lactobacillus rhamnosus, as examples of commensal microbiota.