Antioxidant nanoparticles for the treatment of Age-related Macular Degeneration: preclinical studies in the DKOrd8 mouse model

Abstract

La Degeneració Macular Associada a la Edat (DMAE) és una malaltia ocular degenerativa d’aparició tardana que afecta la retina central i causa una pèrdua progressiva de visió. La DMAE és una malaltia multifactorial en la qual l’envelliment és un dels principals factor de risc i on l’estrés oxidatiu, l’autofàgia i el sistema immunitari tenen una important rellevància en la seva patogènesis. L’exposició constant de llum que pateix la màcula exigeix una elevada activitat metabòlica per part dels fotoreceptors i l’EPR, cosa que genera nivells elevats d’estrés oxidatiu amb un increment de les espècies reactives d’oxigen (ROS). Això indueix canvis a la retina, incloent la acumulació de lipofuscina, una desregulació de l’autofàgia, la presència de druses i inflamació crònica; cosa que acaba provocant la mort del EPR i dels fotoreceptors. Malgrat ser la principal causa de ceguera en els països desenvolupats, encara no existeix un tractament efectiu per a la DMAE. La falta de coneixement sobre els mecanismes implicats en l’aparició de la malaltia així com la falta de models animals recapitulant el fenotip n’han estat els principals obstacles. En els últims anys, els compostos antioxidants han adquirit importància donat el rol que l’estrés oxidatiu juga en l’aparició de la malaltia. Sota aquestes premisses, els objectius d’aquesta tesis han estat (i) la generació i caracterització del ratolí Ccl2-/-; Cx3cr1-/-; Crb1rd8\/rd8, un model murí per a la DMAE; i (ii) el desenvolupament d’una teràpia basada en nanopartícules amb gran capacitat antioxidant. En primer lloc, vam generar el model Ccl2-/-; Cx3cr1-/-; Crb1rd8/rd8 o DKOrd8 a partir dels knockout simples. Mitjançant la seva monitorització in vivo i caracterització post-mortem, vam observar com els ratolins DKOrd8 presentaven diverses característiques fenotípiques típiques de la DMAE al mes d’edat. Els ratolins DKOrd8 presentaven alteracions a l’hemisferi inferior del fons d’ull amb disrupció de la capa de fotoreceptors i una disminució progressiva del seu gruix. Mitjançant immunofluorescència vam observar una acumulació de micròglia a l’espai subretinià, una migració cap a les lesions de la retina i un increment de gliosis. A més, els ratolins DKOrd8 exhibien alteracions en el patró d’expressió gènic, amb afectació en gens relacionats amb l’estrés oxidatiu, el sistema immunitari i les funcions neuronals entre d’altres. En relació al desenvolupament de la teràpia antioxidant, vam sintetitzar unes nanopartícules antioxidants (AOxNPs) no tòxiques amb una capacitat reproduïble de disminuir els nivells intracel·lulars de ROS en cultius in vitro. A més, vam establir l’administració tòpica com una ruta eficient per arribar a la retina, comparable a la injecció intravítria. Finalment, el tractament tòpic amb AOxNPs en els ratolins DKOrd8 va demostrar ser efectiva, aconseguint revertir el patró d’expressió alterat, disminuir la infiltració de micròglia i prevenint l’aprimament de la capa nuclear externa. En conjunt, en aquest treball hem aconseguit generar un model fiable que presenta certes característiques típiques de la DMAE i hem demostrat l’efecte beneficiós de l’administració tòpica de les AOxNPs en la millora de les característiques patològiques del model.

La Degeneración Macular Asociada a la Edad (DMAE) es una enfermedad ocular degenerativa de aparición tardía que afecta a la retina central y causa una pérdida progresiva de visión. La DMAE es una enfermedad multifactorial en la que el envejecimiento es uno de los principales factores de riesgo y en la que el estrés oxidativo, la autofagia y el sistema inmunitario tienen una importante relevancia en su patogénesis. La exposición constante a la luz que sufre la mácula exige una elevada actividad metabólica por parte de los fotorreceptores y del EPR, lo que genera niveles elevados de estrés oxidativo con un incremento de las especies reactivas de oxigeno (ROS). Esto induce cambios en la retina, incluyendo la acumulación de lipofuscina, una desregulación de la autofagia, la presencia de drusas e inflamación crónica; cosa que acaba causando la muerte del EPR y de los fotorreceptores. Aunque es la principal causa de ceguera en países desarrollados, aun no existe un tratamiento efectivo para la DMAE. La falta de conocimiento sobre los mecanismos implicados en la aparición de la enfermedad así como la falta de modelos animales recapitulando el fenotipo han sido los principales obstáculos. En los últimos años, los compuestos antioxidantes han adquirido importancia dado el rol que el estrés oxidativo juga en la aparición de la DMAE. Bajo estas premisas, los objetivos de esta tesis han estado (i) la generación y caracterización del ratón Ccl2-/-; Cx3cr1-/-; Crb1rd8/rd8, un modelo murino para DMAE; y (ii) el desarrollo de una terapia basada en nanopartículas con gran capacidad antioxidante. En primer lugar, generamos el modelo Ccl2-/-; Cx3cr1-/-; Crb1rd8\/rd8 o DKOrd8 a partir de los knockout simples. Mediante su monitorización in vivo y caracterización post-mortem, observamos cómo los ratones DKOrd8 presentaban varias características fenotípicas típicas de la DMAE al mes de edad. Los ratones DKOrd8 presentaban alteraciones en el hemisferio inferior del fondo de ojo con disrupción de la capa de fotorreceptores y una disminución progresiva de su grosor. Mediante inmunofluorescencia observamos una acumulación de microglía en el espacio subretiniano y migración hacia las lesiones de la retina y un incremento de gliosis. Además, los ratones DKOrd8 exhibían alteraciones en el patrón de expresión génica, con afectación en genes relacionados con el estrés oxidativo, el sistema inmunitario y las funciones neuronales entre otros. En relación al desarrollo de la terapia antioxidante, sintetizamos unas nanopartículas antioxidantes (AOxNPs) no tóxicas con capacidad reproducible de disminuir los niveles intracelulares de ROS en cultivos in vitro. Además, establecimos la administración tópica como una ruta eficiente para la llegada a la retina, comparable a la inyección intravítrea. Finalmente, el tratamiento tópico con AOxNPs en los ratones DKOrd8 demostró ser efectivo, consiguiendo revertir el patrón de expresión alterado, disminuir la infiltración de microglía y prevenir el adelgazamiento de la capa nuclear externa. En conjunto, en este trabajo hemos conseguido generar un modelo fiable que presenta ciertas características típicas de la DMAE y hemos demostrado el efecto beneficioso de la administración tópica de las AOxNPs en la mejora de las características patológicas del modelo.

Age-related Macular Degeneration (AMD) is a late-onset degenerative eye disease that affects the central retina and causes progressive vision impairment. AMD is a multifactorial disease, with advanced age being the main risk factor and oxidative stress, autophagy and the immune system playing an important role in its pathogenesis. The constant exposure to light in the macula demands a high metabolic rate for photoreceptors and RPE cells, which generate elevated levels of oxidative stress. These increased levels of ROS induce several changes in the retina, including the accumulation of lipofuscin, the deregulation of autophagy, the presence of drusen and chronic inflammatory responses that end up causing RPE cells death and photoreceptor loss. Despite being the major cause of blindness in developed countries, AMD still does not have an effective treatment available. The lack of knowledge about the mechanisms implicated in the onset of the disease and the lack of animal models recapitulating the phenotype of the disease have been the major obstacles. In the last years, antioxidant compounds have gained importance given the role oxidative stress plays on the onset of the disease. Under these premises, the aim of this thesis was set on (i) the generation and characterization of the Ccl2-/-; Cx3cr1-/-; Crb1rd8\/rd8 mouse, a murine model for AMD; and (ii) the development of a therapy based on nanoparticles with high antioxidant capacity. The Ccl2-/-; Cx3cr1-/-; Crb1rd8/rd8 or DKOrd8 model was generated from the single knockout mice. Its posterior in vivo monitoring and post-mortem characterization revealed that DKOrd8 mice mimicked several AMD-like features already at one month of age. DKOrd8 mice presented alterations in the inferior hemisphere of their eye fundus with disruption and age-dependent decrease of the photoreceptor layer; and alterations in their retinal function at an early age that were maintained upon ageing. Immunofluorescence stainings revealed an age-dependent accumulation of microglia in the subretinal space, migration of the microglia towards the inner retinal lesions and increased gliosis. Moreover, DKOrd8 mice exhibit an altered expression pattern with an affectation of genes involved with oxidative stress, immune regulation and neuronal function among others. Regarding the development of the antioxidant therapy, we synthetize non-toxic antioxidant nanoparticles (AOxNPs) with a reproducible capacity of reducing intracellular ROS levels in in vitro cultures and established the topical administration as an efficient delivery route to reach the retina and posterior segment of the eye comparable to the intravitreal injection. Finally, the topical treatment of DKOrd8 mice with AOxNPs was effective in improving the phenotypical characteristics of the mouse model, as it reverted their altered expression profile, reduced microglia infiltration and prevented the thinning of the outer nuclear layer. Altogether, we generated a reliable mouse model that mimicked certain features of AMD and proved the beneficial effect of the topical AOxNPs in improving the pathological characteristics of the model.