3D Systems for Immune cells culture and their applications in Immunotherapy

Abstract

Noves fites en el camp de la inmunoteràpia, com el desenvolupament de les cèl·lules T modificades genèticament per teràpia cel·lular adoptiva, estan introduïnt estratègies més eficients per combatre el càncer. Tot i així, és un repte produir, manipular i controlar aquestes cèl·lules T. Específicament, la producció de grans quantitats de cèl·lules T, necessàries per aquests tipus de teràpies, en poc temps i de forma econòmica és una gran limitació. En aquesta tesi, hem estudiat diferents sistemes tridimensionals (3D) amb l’objectiu d’aconseguir una major taxa de proliferació cel·lular, així com una modificació dels fenotips resultants, imitant el ambient natural dels òrgans limfoides secundaris.

El Matrigel i una bastida 3D de poliestirè van ser estudiats com les més adients de les opcions disponibles comercialment, ambdós demostrant un augment de la proliferació cel·lular en comparació al mètode estàndard de cultiu en suspensió. Aquesta recerca va demostrar, no només l’efecte benefición de l’adició d’un suport físic en 3D, sino també la imporancia dels factors químics en l’estimulació de l’expansió cel·lular. Malgrat això, aquests sistemes no s’havien dissenyat per a l’imitació d’organs limfoides secundaris, difernt en gran mesura en termes de composició de la matriu extracel·lular. Per aquest motiu, una nova plataforma es va desenvolupar per a millorar els resulats obtinguts prèviament.

El nostre sistema consisteix en hidrogels composats de poli(etilen) glicol (PEG) enllaçats covalentment amb heparina de baix pes molecular (hidrogels PEG-Hep), que van ser produïts i curosament caracteritzats. El PEG composa l’estructura 3D de l’hidrogel, que pot ser manipulat per modificar les propietats mecàniques del sistema. L’heparina, que és una molècula carregada negativament, és utilitzada com un punt d’ancoratge per proteines carregades positivament que poden afectar el comportament cel·lular. Aquesta plataforma va ser aplicada per a l’expansió de cèl·lules immunes sota diferents condicions. Específicament, l’hidrogel tant descarregat com carregat amb citoquines relacionades amb la proliferació de cèl·lules inmunes, com la CCL21 i la CCL19. Totes les condicions van resultar en un agument de la proliferació de cèl·lules T CD4+, però especialment en carregar la CCL21 a l’hidrogel mentre es proporcionava la CCL19 en solució. Aquesta última condició és la que millor emula la matriu extracel·lular dels nodes limfàtics. Així mateix, els fenotips resultants de les cèl·lules T CD4+ cultivades en els hidrogels PEG-Hep van mostrar un augment en el percentatge de cèl·lules TEM en comparació amb les cèl·lules en expandides suspensió.

Els mateixos sistemes van ser aplicats a cèl·lules mononuclears de la sang perifèrica (PBMCs). Tot i que la matriu 3D de poliestirè va millorar els paràmetres de proliferació en comparació al cultiu en suspensió, els efectes beneficiosos obtinguts usant els hidrogels PEG-Hep en el cutliu de cèl·lules T CD4+ no es va poder reproduir en aquesta població.

Finalment, els hidrogels PEG-Hep van ser estudiats com una biotinta per impressió 3D, optimitzant el protocol de la formació dels hidrogels per a la seva aplicació i que va requerir un escalat de la tècnica. Les bastides impreses es van aplicar al cultiu de cèl·lules immunes. Es va observar un augment ens le paràmetres de proliferació de les cèl·lules CD4+ i canvis en els seus fenotips resultants en comparació amb els hidrogels no impresos. En aquest cas, es va observar un increment dels fenotips TCM, el cual es relaciona a la literatura amb bon pronòstic clínic. Per a les PBMCs no es va observar un augment de la proliferació, i els fenotips resultants eren comparables als que es van obtenir sense impressió de l’hidrogel. Tot i així, aquests resultats suggereixen que és necessaria una millor optimització de l’ús dels hidrogels PEG-Hep con a biotinta.

Recientes logros en el campo de la inmunoterapia, como el desarrollo de células T modificadas para su uso como terapia celular adoptivas, están introduciendo estrategias más eficientes para combatir el cáncer. Sin embargo, estas células T son difíciles de producir, manipular y controlar. Concretamente, existen limitaciones en la producción de las grandes cantidades de células T necesarias para estas terapias en un corto período de tiempo y de una manera económicamente viable. En esta tesis, hemos estudiado diferentes sistemas tridimensionales (3D) con el objetivo de conseguir una mayor tasa de proliferación celular, así como una modificación de los fenotipos resultantes, imitando el ambiente natural de los órganos linfoides secundarios.

Matrigel y un soporte en 3D de poliestireno se estudiaron como dos de las opciones disponibles comercialmente. Ambos mostraron un aumento en la proliferación celular en comparación con los sistemas de suspensión estándar. Esta investigación demostró no solo el efecto beneficioso de la adición de un soporte físico 3D, sino también la importancia del factor químico para los estímulos de la expansión celular. Sin embargo, estos sistemas no fueron diseñados para imitar órganos linfoides secundarios, difiriendo significativamente en términos de composición de la matriz extracelular. Por este motivo, una nueva plataforma se desarrolló para mejorar los resultados previamente obtenidos.

Esta nueva plataforma fueron hidrogeles compuestos por polietilenglicol (PEG) y heparina de bajo peso molecular (hidrogeles de PEG-Hep) que reaccionan covalentemente produciendo la gelificación. Estos hidrogeles se sintetizaron y caracterizaron completamente para este propósito. El PEG compone la estructura 3D del hidrogel, que puede ser manipulado para modificar las propiedades mecánicas del sistema. La heparina, que es una molécula cargada negativamente, es utilizada como un punto de anclaje para proteínas cargadas positivamente que pueden afectar el comportamiento celular. Este sistema se aplicó a la expansión de las células inmunes bajo diferentes estrategias, como el uso del hidrogel sin la adicción de ningún estímulo químico, o con la adición de citoquinas relacionadas con la proliferación de células inmunes como CCL21 y CCL19. Se obtuvo un aumento de la proliferación de células T CD4 + para todas las condiciones, pero los valores más altos se obtuvieron con la adición de CCL21 al hidrogel y CCL19 en solución, que son las condiciones que imitan mejor la matriz extracelular de los nodos linfáticos. Asimismo, los fenotipos resultantes de las células T CD4 + cultivadas en los hidrogeles PEG Hep mostraron un aumento en el porcentaje de células TEM en comparación con las células expandidas en suspensión.

Los mismos sistemas se aplicaron a las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Aunque el poliestireno 3D mejoró los parámetros de proliferación en comparación con los sistemas de suspensión, los resultados beneficiosos obtenidos con los hidrogeles de PEG-Hep para el cultivo de células T CD4 + no pudieron reproducirse para esta población.

Finalmente, los hidrogeles PEG-Hep fueron estudiados como una biotinta impresión 3D, optimizando el protocolo de la formación de los hidrogeles para su aplicación y que requirió un escalado de la técnica. Las plataformas impresas se aplicaron al cultivo de células inmunes. Se observó un aumento de los parámetros de proliferación de las células CD4 + y cambios en sus fenotipos resultantes en comparación con los hidrogeles no impresos. En este caso, se observó un incremento del fenotipo TCM, el cual se relaciona con alta eficacia clínica. Para las PBMC no se observó un aumento de la proliferación, y los fenotipos resultantes eran comparables a los que se obtuvieron sin la impresión del hidrogel, sugiriendo que una mejor optimización del uso de los hidrogeles PEG-Hep cono a biotinta de impresión 3D todavía es necesaria.

Recent achievements in the field of immunotherapy, such as the development of engineered T cells used in adoptive cell therapy, are introducing more efficient strategies to combat cancer. Nevertheless, these T cells are challenging to manufacture, manipulate, and control. Specifically, there are limitations in producing the large amounts of T cells needed for these therapies in a short period of time and in an economically viable manner. In this thesis, we have studied different 3D systems with the objective of achieving higher proliferation rates and tune the resulting phenotypes, resembling the natural environment of the secondary lymphoid organs.

Matrigel and a 3D polystyrene scaffold were studied as two of the most suitable commercially available options, showing an increase in cell proliferation compared to standard suspension systems. This research proved not only the beneficial effect of the addition of a 3D physical support, but also the importance of the chemical input to stimulate cell expansion. However, these systems were not designed for secondary lymphoid organ mimicking and thus, they significantly differ in terms of ECM composition. Consequently, a new platform was developed for this application to improve the obtained results.

Hydrogels composed of poly(ethylene) glycol (PEG) covalently combined with low molecular weight heparin (PEG-Hep hydrogels) were synthesized and completely characterized for this purpose. PEG confers the 3D structure to the hydrogel, and can be manipulated to change its mechanical properties. Heparin, which is a negatively charged molecule, is used as an anchor for positively charged proteins that can affect cell behavior. This system was used for immune cell expansion under different conditions, specifically, unloaded hydrogels were employed as well as hydrogels loaded with cytokines related to immune cell proliferation like CCL21 and CCL19. All the conditions resulted in an increase of CD4+ T cell proliferation but the highest proliferation indexes were achieved with hydrogels loaded with CCL21 together with the addition of CCL19 in suspension, which are the conditions that best mimic the extracellular matrix of lymph nodes. Besides, the resulting phenotypes of CD4+ T cells cultured in PEG Hep hydrogels showed an increase of the TEM percentage in comparison with cells expanded in suspension.

The same systems were used for peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). 3D polystyrene improved the proliferation parameters in comparison with suspension systems. However, the killing capacity of the resulting cells did not change in comparison with cells cultured in suspension due to the lack of chemical input in this system. The beneficial results obtained with PEG-Hep hydrogels for the culture of CD4+ T cells could not be reproduced for this population. Nevertheless, PEG-Hep hydrogels did show an effect in the resulting phenotypes achieved, increasing the CD45RO+/CD62L- percentage (TEM population for T cells).

Finally, PEG-Hep hydrogels were studied as bioink for 3D printing, optimizing the protocol of hydrogel formation for this application which required a scaling up process. The resulting printed scaffolds were applied to immune cell culture. It was observed increases in the proliferation parameters of CD4+ T cells and changes in their resulting phenotypes in comparison with non-printed hydrogels. In this case an increase in the TCM phenotype was observed, which is related to good clinical outcomes. For PBMCs no proliferation enhancement was observed and the resulting phenotypes were comparable with the ones obtained without printing. However, a further optimization of the use of PEG-Hep hydrogels as bioink for 3D printing is still necessary.