Functional analysis of candidate genes for meat quality traits and muscle transcriptomics in pigs

Abstract

Avui dia el consum mundial de carn està creixent, sent la carn de porc una de les més consumides. La millora de la qualitat de la carn està subjecta als requisits del consumidor per productes carnis més saludables i saborosos. La composició dels àcids grassos i el greix intramuscular són factors determinants de la qualitat de carn, encara que hi ha involucrada una xarxa complexa de processos i vies. L’objectiu de la present tesi va ser dilucidar els mecanismes moleculars que afecten la composició d’àcids grassos en porcs.

Hem estudiat l’expressió de gens candidats relacionats amb els caràcters de deposició del greix intramuscular i la composició d’àcids grassos, seleccionats en estudis previs del nostre grup. Els nivells d’expressió del ARNm de 45 gens es van mesurar mitjançant RT-qPCR en un total de 355 porcs pertanyents a tres retrocreuaments experimentals diferents basats en mascles Ibèrics. El eGWAS va identificar dues regions cis-eQTLs per als gens IGF2 i ACSM5, i deu trans-eQTLs. El eGWAS realitzat per a cada retrocreuament per separat va revelar diferents regions eQTLs així com sis trans-eQTL hotspots, dos per retrocreuament, suggerint que variants genètiques específiques de cada raça estan regulant l’expressió d’aquests gens candidats.

A més, el nostre objectiu va ser estudiar l’associació entre el polimorfisme IGF2:g.3072G>A i l’expressió del gen IGF2, així com el seu efecte en la composició d’àcids grassos del greix dorsal de 355 porcs pertanyents als tres retrocreuament. El eGWAS va identificar una regió cis-eQTL associada a l’expressió del gen IGF2 en el teixit adipós, sent el polimorfisme IGF2:g.3072G>Al més significativament associat. Així mateix, l’expressió del gen IGF2, tant en múscul com en teixit adipós, va ser explicada per un model d’impressió genètica. Finalment, els animals portadors de l’al·lel A van mostrar un major percentatge de PUFA i un menor percentatge de MUFA en teixit adipós.

Per a entendre millor la regulació i funció del miR-33a i el miR-33b en el metabolisme dels lípids en porc, hem estudiat l’expressió d’aquests miRNAs en fetge, teixit adipós i múscul, i la seva associació amb la composició dels àcids grassos. Un total de 42 porcs van ser analitzats i es van observar diferents patrons d’expressió per a tots dos miRNAs segons el teixit, la qual cosa suggereix que els mecanismes reguladors de l’expressió depenen del teixit. Les altes correlacions entre l’expressió del miR-33a i el miR-33b en teixit adipós i múscul van indicar una regulació similar. Per contra, la baixa correlació entre els dos miRNAs en fetge va suggerir una funció i regulació diferents, i el miR-33b sembla estar involucrat en la β-oxidació dels àcids grassos. Finalment, les correlacions significatives entre l’expressió del miR-33a i el miR-33b en fetge i teixit adipós i la composició dels àcids grassos del teixit adipós reforcen la hipòtesi del paper d’aquests miRNAs en la regulació del metabolisme lipídic.

Finalment, es va realitzar un estudi preliminar del transcriptoma del múscul en 132 porcs del retrocreuament BC1_DU mitjançant RNA-Seq, amb l’objectiu d’identificar potencials reguladors de l’expressió gènica en múscul. Els eGWAS van identificar un total de 324 eQTL, dels quals 247 van ser classificats com cis-eQTLs i 77 com a trans-eQTLs. Les dues associacions més significatives es van trobar per als gens HGFAC i HUS1. Els principals processos identificats per a l’expressió dels 291 gens amb eQTLs significatius van ser les vies metabòliques. Finalment, HNF4A, KLF3, E2F4, mir-483 i el gen RORC es van proposar com els principals factors de transcripció, receptors nuclears o miRNAs implicats en la regulació de l’expressió gènica del múscul.

Hoy en día el consumo mundial de carne está creciendo, siendo la carne de cerdo una de las más consumidas. La mejora de la calidad de la carne está sujeta a los requisitos del consumidor por productos cárnicos más saludables y sabrosos. La composición de los ácidos grasos y la grasa intramuscular son factores determinantes de la calidad de carne, aunque hay involucrada una red compleja de procesos y vías. El objetivo de la presente tesis fue dilucidar los mecanismos moleculares que afectan a la composición de ácidos grasos en cerdos.

Estudiamos la expresión de genes candidatos relacionados con los caracteres de deposición de la grasa intramuscular y la composición de ácidos grasos, seleccionados en estudios previos de nuestro grupo. Los niveles de expresión del ARNm de 45 genes se midieron mediante RT-qPCR en un total de 355 cerdos pertenecientes a tres retrocruces experimentales diferentes basados en machos Ibéricos. El eGWAS identificó dos regiones cis-eQTLs para los genes IGF2 y ACSM5, y diez trans-eQTLs. El eGWAS realizado para cada retrocruce por separado reveló diferentes regiones eQTLs así como seis trans-eQTL hotspots, dos por retrocruce, sugiriendo que variantes genéticas específicas de cada raza están regulando la expresión de estos genes candidatos.

Además, nuestro objetivo fue estudiar la asociación entre el polimorfismo IGF2:g.3072G>A y la expresión del gen IGF2, así como su efecto en la composición de ácidos grasos de la grasa dorsal de 355 cerdos pertenecientes a los tres retrocruces. El eGWAS identificó una región cis-eQTL asociada a la expresión del gen IGF2 en el tejido adiposo, siendo el polimorfismo IGF2:g.3072G>A el más significativamente asociado. Asimismo, la expresión del gen IGF2, tanto en músculo como en tejido adiposo, fue explicada por un modelo de impronta genética. Finalmente, los animales portadores del alelo A mostraron un mayor porcentaje de PUFA y un menor porcentaje de MUFA en tejido adiposo.

Para entender mejor la regulación y función del miR-33a y el miR-33b en el metabolismo de los lípidos en cerdo, estudiamos la expresión de estos miRNAs en hígado, tejido adiposo y músculo, y su asociación con la composición de los ácidos grasos. Un total de 42 cerdos fueron analizados y se observaron diferentes patrones de expresión para ambos miRNAs según el tejido, lo que sugiere que los mecanismos reguladores de la expresión dependen del tejido. Las altas correlaciones entre la expresión del miR-33a y el miR-33b en tejido adiposo y músculo indicaron una regulación similar. Por el contrario, la baja correlación entre los dos miRNAs en hígado sugirió una función y regulación diferentes, y el miR-33b parece estar involucrado en la β-oxidación de los ácidos grasos. Por último, las correlaciones significativas entre la expresión del miR-33a y el miR-33b en hígado y tejido adiposo y la composición de los ácidos grasos del tejido adiposo refuerzan la hipótesis del papel de estos miRNAs en la regulación del metabolismo lipídico.

Finalmente, se realizó un estudio preliminar del transcriptoma del músculo en 132 cerdos del retrocruce BC1_DU mediante RNA-Seq, con el objetivo de identificar potenciales reguladores de la expresión génica en músculo. Los eGWAS identificaron un total de 324 eQTL, de los cuales 247 fueron clasificados como cis-eQTLs y 77 como trans-eQTLs. Las dos asociaciones más significativas se encontraron para los genes HGFAC y HUS1. Los principales procesos identificados para la expresión de los 291 genes con eQTLs significativos fueron las vías metabólicas. Por último, HNF4A, KLF3, E2F4, mir-483 y el gen RORC se propusieron como los principales factores de transcripción, receptores nucleares o miRNAs implicados en la regulación de la expresión génica del músculo.

Nowadays, global meat consumption is rising, being pork one of the most consumed meats. The improvement of meat quality is subjected to consumer preferences for healthier and tastier meat products. Fatty acid composition and intramuscular fat are important factors determining meat quality traits, although a complex network of processes and pathways are involved. In the present thesis we aimed to elucidate the molecular mechanisms affecting fatty acid composition in pigs.

We studied the expression of candidate genes affecting intramuscular fat deposition and fatty acid composition traits, selected in previous studies of our group. The mRNA expression level of 45 genes was measured by RT-qPCR in a total of 355 pigs belonging to three different backcrosses based on Iberian boards. The eGWAS identified two cis-eQTL regions for IGF2 and ACSM5 genes, and ten trans-eQTL effects. The eGWAS performed in each backcross individually revealed different eQTL regions as well as six trans-eQTL hotspots, two per backcross, suggesting that breed-specific genetic variants are regulating the expression of these candidate genes.

Furthermore, we aimed to study the association between the IGF2:g.3072G>A polymorphism and the IGF2 gene expression, and its effect on fatty acid composition in backfat adipose tissue in 355 pigs belonging to the three backcrosses. The eGWAS identified a cis-eQTL region associated with the IGF2 gene expression in adipose tissue, being the IGF2:g.3072G>A polymorphism the most significantly associated SNP. In addition, the IGF2 gene expression in both muscle and adipose tissue was explained by an imprinting model. Finally, animals carrying the A allele showed a higher PUFA and lower MUFA percentages in adipose tissue.

To better understand the regulation and role of miR-33a and miR-33b in porcine lipid metabolism, we studied the expression of these miRNAs in liver, adipose tissue and muscle, and their association with fatty acid composition. A total of 42 pigs were analysed and different expression patterns among tissues were observed for both miRNAs, suggesting that expression regulatory mechanisms are tissue dependent. In adipose tissue and muscle, a high correlation between miR-33a and miR-33b expression was observed, indicating a similar regulation. Conversely, a low correlation between the two miRNAs in liver suggests a different regulation and function, and the miR-33b may be involved in fatty acid β-oxidation. Lastly, significant correlations among the expression of miR-33a and miR-33b in liver and adipose tissue and the adipose tissue fatty acid composition reinforced the involvement of these miRNAs in the regulation of lipid metabolism.

Finally, a preliminary study on muscle transcriptome of 132 pigs by RNA-Seq was performed with the aim to identify potential muscle gene-expression regulators. The eGWAS identified a total of 324 eQTLs, of which 247 were classified as cis-eQTL and 77 as trans-eQTLs. The two most significant associations were found for HGFAC and HUS1 genes. The main processes identified for the expression of 291 genes with significant eQTLs were metabolic pathways and the top three canonical pathways were Granzyme B signalling, glutathione-mediated detoxification and NRF2-mediated Oxidative Stress Response. At last, HNF4A, KLF3, E2F4, mir-483 and RORC were proposed as the main transcription factors, nuclear receptors or miRNAs involved in the muscle gene expression regulation.