The forgotten world of mycobiome in the skin of dogs

Abstract

La paraula microbioma inclou el conjunt de microbis que habiten un microhàbitat comú. Els mètodes de seqüenciació de nova generació van permetre la caracterització de les comunitats microbianes que viuen en les diferents parts del cos, tant humà com animals, la seva diversitat, les interaccions amb l’hoste (cèl·lula o immunitat), l’ambient i també entre microbis.

El primer objectiu és caracteritzar les comunitats bacterianes i fúngiques de la pell dels gossos amb otitis externa, mitjançant seqüenciació masiva (amb sequenciador Ion Torrent) amb una avaluació longitudinal després d’un tractament antibiòtic i no-antibiòtic. Els resultats van demostrar que un tractament amb corticoides tòpics més un agent antimicrobian natural, la magrana, va ser adequat pel control del sobrecreixement bacterià i fúngic. Les anàlisis amb seqüenciació de nova generació van permetre comprendre millor la dinàmica de l’otitis canina i van demostrar que el compost natural de la magrana seria una bona alternativa antimicrobiana per a una infecció lleu.

El segon objectiu és identificar els fongs a nivell d’espècie mitjançant el desenvolupament i l’optimització d’un assaig de seqüenciació basat en fragments llargs, per captar la màxima variabilitat i informació taxonòmica de l’operó ribosòmic de fongs sencer. Es va avaluar la seqüenciació de tercera generació per nanopors amb el dispositiu MinION (Oxford Nanopore Technologies), per poder seqüenciar l’operó rRNA de fongs sencer comparant les dues regions ITS1 i ITS2 juntes (3.5 Kb de longitud) amb els amplicons de l’operó sencer (6 Kb de longitud). Els amplicons de 6 Kb van proporcionar una millor tasca taxonòmica pels fongs, tot i que per alguns d’ells totes dues les mides dels amplicons van ser adequades. Aquesta tecnologia va ser un bon enfocament per a la caracterització de les comunitats de fongs en mostres complexes, i arribant al nivell d’espècie per al fong més abundant; Malassezia spp.

El tercer objectiu és avaluar la seqüenciació de nanopors per a l’assemblatge dels genomes de fongs. Malassezia és un fong comensal de la pell en mamífers, i la Malassezia pachydermatis és l’espècie de més importància veterinària. El seu sobrecreixement està correlacionat amb algunes malalties com l’otitis o la dermatitis. L’ADN es va extreure d’un cultiu microbiològic i es va seqüenciar amb nanopors mitjançant el dispositiu MinION. Les anàlisis de bioinformàtica van incloure la ultima versió de basecalling i correcció de seqüencies consensus. El genoma complet (8.6 Mb) en 10 contigs va demostrar un assemblatge millor respecte al genoma de referencia (64 contigs) i amb una completeness similar (76.6%).

La palabra microbioma incluye el conjunto de microbios que habitan un microhábitat común. Los métodos de secuenciación de nueva generación permitieron la caracterización de las comunidades microbianas que viven en las diferentes partes del cuerpo, tanto humano como animales, su diversidad, las interacciones con el huésped (célula o inmunidad), el ambiente y también entre microbios.

El primer objetivo es caracterizar las comunidades bacterianas y fúngicas de la piel de los perros con otitis externa, mediante secuenciación masiva (Ion Torrent) con una evaluación longitudinal tras un tratamiento antibiótico y no-antibiótico. Los resultados demostraron que un tratamiento tópico con corticoides más un agente antimicrobiano natural, la granada, fue adecuado para el control del sobrecrecimiento bacteriano y fúngico. Los análisis con secuenciación de nueva generación permitieron comprender mejor la dinámica de la otitis canina y demostraron que el compuesto natural de la granada sería una buena alternativa antimicrobiana para una infección leve.

El segundo objetivo es identificar los hongos a nivel de especie mediante el desarrollo y la optimización de un ensayo de secuenciación basado en fragmentos largos, para captar la máxima variabilidad e información taxonómica del operón ribosómico de hongos entero. Se evaluó la secuenciación de tercera generación para nanopors con el dispositivo MinION (Oxford Nanopore Technologies), para poder secuenciar las dos regiones ITS1 y ITS2 juntas (3.5 Kb de longitud) con los amplicones del operón entero (6 Kb de longitud). Los amplicones de 6 Kb proporcionaron una mejor labor taxonómica por los hongos, aunque para algunos de ellos fueron adecuados ambos tamaños de los amplicones. Esta tecnología fue un buen enfoque para la caracterización de las comunidades de hongos en muestras complejas, y llegando al nivel de especie para el hongo más abundante: Malassezia spp.

El tercer objetivo es evaluar la secuenciación de nanopores para el ensamblaje de los genomas de hongos. Malassezia es un hongo comensal de la piel en mamíferos, y la Malassezia pachydermatis es la especie de mayor importancia veterinaria. Su sobrecrecimiento está correlacionado con algunas enfermedades como la otitis o la dermatitis. L’ADN se extrajo de un cultivo microbiológico y se secuenció con nanopores mediante el dispositivo MinION. Los análisis de bioinformática incluyeron la última versión de basecalling y corrección de secuencias consenso. El genoma completo (8.6 Mb) en 10 contigs, demostró un ensamblaje mejor respecto al genoma de referencia (64 contigs) y con una completeness similar (76.6%).

The word microbiome includes the set of microbes that inhabit a common microhabitat. It refers not only to the bacterial community but to fungi and viruses too. Next-generation sequencing methods allowed the characterization of the microbial communities living in different part of the body either human or animal, their diversity, the interactions with the host (cell or immunity), the environment and the microbes.

The first objective is to characterize the skin bacterial and fungal communities in otitis externa in dogs by massive sequencing (Ion Torrent), with a longitudinal evaluation after antibiotic and non-antibiotic treatment. Results showed that a treatment of topical corticosteroid plus a natural antimicrobial agent, pomegranate, was suitable for the control of bacterial and fungal overgrowth. Next generation sequencing analyses permitted to better understand the dynamics of the canine otitis and showed that the pomegranate natural compound would be a good antimicrobial alternative for a mild infection.

The second objective is to identify fungi at the species level by the development and optimization of a sequencing assay based on long-fragments, to capture the maximum variability and taxonomical information from the whole fungal ribosomal operon. We evaluated the third-generation sequencing by nanopores with the MinION device to be able to sequence the targeting ITS1 and ITS2 regions together (3.5 Kb length) with amplicons targeting the whole ribosomal operon (6 Kb length). We validated the strategy with six microbiological fungal cultures and four otitis samples. MinION sequencing detected most of the microbiological fungal cultures and confirmed the phenotypic characterization of the two otitis samples. The amplicons targeting the whole ribosomal operon (6 Kb) provided a better taxonomic assignment for fungi, although for some of them, both amplicons sizes were suitable. Finally, Nanopore Technologies was a good approach for the characterization of the fungal communities in complex samples, reaching the species level for the most abundant fungus found: Malassezia spp.

The third objective is to evaluate nanopore sequencing for the assembly of fungal genomes. Malassezia is a skin commensal fungus in mammals, and Malassezia pachydermatis is the species of more significant veterinary concern. Its overgrowth is correlated with diseases like otitis or dermatitis. The DNA was extracted from a microbiological culture and nanopore sequenced with MinION. The bioinformatics analyses included the last high accuracy basecalling and consensus correction workflows. The genome assembly of 8.6 Mbp in 10 contigs improved the assembly and the scaffolding of the reference genome (64 contigs), with similar completeness (76.6%).