Papel del plasma seminal en el control de la inflamación endometrial postinseminación en équidos

Abstract

Els rucs (Equus asinus), són una espècie d’origen salvatge, segurament la primera a ser domesticada per l’home. Durant segles va ser indispensable en les tasques de camp, però la mecanització el va portar gairebé a la desaparició. Avui en dia, la importància d’aquesta espècie ha tornat a créixer gràcies a l’interès del seu ús cap a nous camps. Com a conseqüència l’interès per la reproducció de l’ase ha augmentat en els últims anys.

La inducció d’ovulacions fèrtils és fonamental per a l’aplicació d’aquestes tecnologies reproductives i la seva millora. Al primer treball de la present Tesi es planteja utilitzar l’ecografia Doppler Color com a instrument per controlar la vascularització de el cos luti de la burra i així poder determinar el millor moment per administrar PGF2a i induir la lúteolisis que es produeix entre les 3 i 5 hores després de l’aplicació d’una prostaglandina i és el resultat d’una isquèmia del cos luti amb la consegüent pèrdua de funcionalitat d’aquest i baixada dels nivells plasmàtics de progesterona. La inseminació artificial (AI) de someres amb semen congelat-descongelat de ruc s’associa amb baixes taxes de fertilitat. L’addició de plasma seminal (SP), eliminant durant el procés de congelació, o l’augment de la concentració espermàtica, han mostrat un cert increment d’aquestes taxes d’embaràs. D’altra banda, a la burra es va observar una exagerada resposta inflamatòria poques hores després de la inseminació amb possible relació amb la baixa fertilitat. En estudis previs es va analitzar aquesta resposta mitjançant la recuperació de neutròfils polimorfonuclears (PMN) de rentats uterins post-AI. No obstant això, la repetició d’aquests rentats pot afectar negativament a l’endometri i provocar problemes de fertilitat. Per aquesta raó, al segon article s’ha realitzat un conjunt d’experiments per poder establir un model in vitro mitjançant la recol·lecció de PMN de la sang perifèrica de les someres, provant com afecta la concentració d’espermatozoides a la seva interacció amb els PMN. S’ha obtingut un model vàlid per poder recrear in vitro les condicions fisiològiques que es donen in vivo. S’ha conclòs que el SP té capacitat per activar els PMN. D’altra banda, s’ha observat una escassa fagocitosi d’espermatozoides mentre la major part d’aquests apareixen units a la superfície dels PMN o en un halo circumdant. Així mateix, bona part d’aquests es mantenen vius, amb un intens moviment de cua i, en les concentracions superiors a 500x106 alguns poden alliberar-se amb una excel·lent mobilitat després de 3h d’incubació a 37ºC.

El paper de SP sembla ser molt important en la modulació d’aquesta inflamació fisiològica de les someres. Per facilitar el seu estudi, l’objectiu d’el tercer experimental va ser fraccionar el plasma seminal de ruc basant-se en el pes molecular de les proteïnes i analitzar l’efecte sobre la motilitat spz i la interacció PMN: spz. De l’SP de cinc rucs es van obtenir 6 fraccions (<3 / 3-10 / 10-30 / 30-50 / 50-100 /> 10 kDa) que es van posar en contacte amb una solució de PMN: spz i es van incubar a 37ºC . A 1h, 2h, 3h, 4h es va avaluar la motilitat espermàtica amb sistema CASA (ISAS®, la viabilitat dels espermatozoides mitjançant una tinció eosinanigrosina i la interacció PMN: spz mitjançant una triple tinció Diff-QuikR.

Les fraccions de SP que inclouen proteïnes entre 30-50 kDa i 50-100kDa van mostrar el millor manteniment de les subpoblacions mòbils de spz de ruc així com estan involucrades en el control de la resposta inflamatòria post-AI de la burra. Diverses proteïnes involucrades en la fecundació tenen un pes molecular entre 30 i 100 kDa.

Los burros (Equus asinus), son una especie de origen salvaje, seguramente la primera en ser domesticada por el hombre. Durante siglos fue indispensable en las tareas del campo, pero la mecanización lo llevó casi a la desaparición. Hoy en día, la importancia de esta especie ha vuelto a crecer gracias al interés de su uso hacia nuevos campos. Como consecuencia el interés por la reproducción del burro ha aumentado en los últimos años. La inducción de ovulaciones fértiles es fundamental para la aplicación de dichas tecnologías reproductivas y su mejora. En el primer trabajo de la presente Tesis se plantea utilizar la ecografía Doppler Color como instrumento para controlar la vascularización del cuerpo lúteo de la burra y así poder determinar el mejor momento para administrar PGF2a e inducir la luteólisis que se produce entre las 3 y 5 horas tras la aplicación de una prostaglandina y es el resultado de una isquemia del cuerpo lúteo con la consiguiente pérdida de funcionalidad de este y bajada de los niveles plasmáticos de progesterona. La inseminación artificial (AI) de burras con semen congelado-descongelado de burro se asocia con bajas tasas de fertilidad. La adición de plasma seminal (SP), eliminando durante el proceso de congelación, o el aumento de la concentración espermática, han mostrado un cierto incremento de dichas tasas de preñez. Por otro lado, en la burra se observó una exagerada respuesta inflamatoria pocas horas después de la inseminación con posible relación con la baja fertilidad. En estudios previos se analizó esta respuesta mediante la recuperación de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) de lavados uterinos post-AI. No obstante, la repetición de estos lavados puede afectar negativamente al endometrio y provocar problemas de fertilidad. Por esta razón, en el segundo artículo se ha realizado un conjunto de experimentos para poder establecer un modelo in vitro mediante la recolección de PMN de la sangre periférica de las burras, probando cómo afecta la concentración de espermatozoides a su interacción con los PMN. Se ha obtenido un modelo válido para poder recrear in vitro las condiciones fisiológicas que se dan in vivo. Se ha concluido que el SP tiene capacidad para activar los PMN. Por otro lado, se ha observado una escasa fagocitosis de espermatozoides mientras la mayor parte de estos aparecen unidos a la superficie de los PMN o en un halo circundante. Así mismo, buena parte de estos se mantienen vivos, con un intenso movimiento de cola y, en las concentraciones superiores a 500x106 algunos pueden liberarse con una excelente movilidad tras 3h de incubación a 37ºC. El papel de SP parece ser muy importante en la modulación de esta inflamación fisiológica de las burras. Para facilitar su estudio, el objetivo del tercer experimental fue fraccionar el plasma seminal de burro basándose en el peso molecular de las proteínas y analizar el efecto sobre la motilidad spz y la interacción PMN:spz. Del SP de cinco burros se obtuvieron 6 fracciones (<3 / 3–10 / 10–30 / 30–50 / 50–100 /> 10 kDa) que se pusieron en contacto con una solución de PMN:spz y se incubaron a 37ºC. A 1h, 2h, 3h, 4h se evaluó la motilidad espermática con sistema CASA (ISAS®, la viabilidad de los espermatozoides mediante una tinción eosinanigrosina y la interacción PMN:spz mediante una triple tinción Diff-QuikR. Las fracciones de SP que incluyen proteínas entre 30-50 kDa y 50-100kDa mostraron el mejor mantenimiento de las subpoblaciones móviles de spz de burro así como están involucradas en el control de la respuesta inflamatoria post-AI de la burra. Varias proteínas involucradas en la fecundación tienen un peso molecular entre 30 y 100 kDa.

Donkeys (Equus asinus), are a species of wild origin, surely the first to be domesticated by man. For centuries it was indispensable in the tasks of the field, but mechanization almost led to its disappearance. Today, the importance of this species has grown again thanks to the interest of its use in new fields. As a consequence, interest in donkey breeding has increased in recent years.

The induction of fertile ovulations is essential for the application of these reproductive technologies and their improvement. In the first work of this thesis, it is proposed to use Color Doppler ultrasound as an instrument to control the vascularization of the jennies’ corpus luteum and thus be able to determine the best time to administer PGF2a and induce luteolysis that occurs between 3 and 5 hours. after the application of a prostaglandin and is the result of an ischemia of the corpus luteum with the consequent loss of functionality of the corpus luteum and a decrease in plasma progesterone levels. Artificial insemination (AI) of jennies with frozen-thawed donkey semen is associated with low fertility rates. The addition of seminal plasma (SP), eliminating during the freezing process, or the increase in sperm concentration, have shown a certain increase in these pregnancy rates. On the other hand, in the jenny an exaggerated inflammatory response was observed a few hours after insemination, possibly related to low fertility. Previous studies have analyzed this response by recovering polymorphonuclear neutrophils (PMN) from post-AI uterine lavages. However, repetition of these washes can adversely affect the endometrium and lead to fertility problems. For this reason, in the second article, a set of experiments has been carried out to establish an in vitro model by collecting PMN from the peripheral blood of jennies, testing how the concentration of sperm affects their interaction with PMN. A valid model has been obtained to be able to recreate in vitro the physiological conditions that occur in vivo. It has been concluded that the SP has the capacity to activate the PMN. On the other hand, little sperm phagocytosis has been observed while most of these appear attached to the surface of the PMN or in a surrounding halo. Likewise, a good part of these are kept alive, with an intense tail movement and, in concentrations above 500x106, some can be released with excellent mobility after 3h incubation at 37ºC.

The role of SP appears to be very important in modulating this physiological inflammation of jennies. To facilitate their study, the objective of the third experiment was to fractionate donkey seminal plasma based on the molecular weight of proteins and to analyze the effect on spz motility and PMN: spz interaction. From the SP of five donkeys, 6 fractions (<3 / 3–10 / 10–30 / 30–50 / 50–100 /> 10 kDa) were obtained, which were contacted with a PMN: spz solution and incubated at 37ºC. . At 1h, 2h, 3h, 4h, sperm motility was evaluated with the CASA system (ISAS®), the viability of the sperm using an eosinigrosin stain and the PMN: spz interaction using a triple Diff-QuikR stain.

SP fractions including proteins between 30-50 kDa and 50-100kDa showed the best maintenance of the mobile sub-populations of donkey spz as well as are involved in the control of the jennies’ post-AI inflammatory response. Several proteins involved in fertilization have a molecular weight between 30 and 100 kDa.