Modulation of porcine production and molecular phenotypes by nutrition and genetics

Abstract

La regulació de l’engreixament porcí i la qualitat de la carn són encara poc coneguts. Inicialment, vam investigar la variabilitat de gens candidats localitzats a regions QTL associades amb caràcters de qualitat de la carn i contingut i composició de greix intramuscular. Vam identificar polimorfismes en aquests gens candidats a partir de dades d’RNA-seq i seqüències de genoma complet (WGS) de cinc porcs Duroc. El genotip d’ATP1A2 va ser significativament associat a la conductivitat elèctrica (CE) del múscul longissimus dorsi (LD) a nivell cromosòmic. Els nostres resultats suggereixen que el gen ATP1A2 pot estar involucrat en la regulació de la CE en el múscul. D’altra banda, vam fer ús de les dades de WGS per localitzar mutacions stop gained segregant en una població Duroc (Lipgen). Van ser identificats set porcs homozigots per una mutació potencialment letal en el gen ASS1. Després de seqüenciar aquesta regió a nivell genòmic i transcriptòmic, es va revelar la presència d’una mutació immediatament abans, que eliminaria el codó d’aturada, generant un polimorfisme dinucleotídic que causa un canvi benigne d’aminoàcid en la seqüència d’ASS1.

Seguidament, vam utilitzar dades prèvies d’expressió diferencial d’RNA-seq per investigar l’associació de gens candidats amb caràcters de qualitat de la carn. Dos polimorfismes localitzats en els gens CRY2 i MIGA2 van mostrar associacions significatives amb el contingut d’àcid esteàric en LD, i amb la concretació d’LDL en sèrum, respectivament. Aquests polimorfismes també van ser associats amb l’expressió dels seus gens respectius. Anàlisis a nivell cromosòmic van mostrar que aquests polimorfismes poden no ser els SNPs casuals. També vam analitzar els polimorfismes localitzats en gens microRNA a partir d’un total de 120 WGS de porcs domèstics i salvatges d’Àsia i Europa. La variabilitat de regions miRNA va ser molt reduïda en la seed comparat amb altres regions del miRNA i amb la resta del genoma. Quinze SNPs en gens miRNA van ser genotipats en la població Lipgen. Els resultats van revelar, entre d’altres, una variant localitzada en el bucle apical d’ssc-miR-326 significativament associada amb l’expressió d’alguns dels seus mRNAs diana. Aquest SNP pot contribuir a la reestructuració de l’aparellament de bases a la forquilla del miRNA, modificant l’eficiència de la maduració del propi miRNA.

Altrament, ens vam proposar millorar l’encara limitada anotació del miRNAoma porcí mitjançant el desenvolupament d’un pipeline bioinformàtic per a la identificació i anotació de gens miRNA. La fracció d’RNA petit de 48 porques Duroc va ser seqüenciada per detectar miRNAs nous i ja coneguts. Els transcrits de dades d’small RNA-seq i miRNAs madurs anotats en humà van ser cartografiades en el genoma porcí. Es van reconstruir seqüències candidates mitjançant la cerca de motius nucleotídics. Es van obtenir un conjunt de paràmetres de seqüència i termodinàmics de cada seqüència i es va fer servir un algoritme de Machine Learning basat en grafs per predir miRNAs, tant nous com coneguts. Van ser descoberts un total de 47 miRNAs porcins putatius. L’expressió de tres d’ells va ser avaluada mitjançant tècniques d’RT-qPCR i confirmada en una població independent de porcs de raça Göttingen minipig.

Finalment es van utilitzar les dades d’small RNA-seq per determinar miRNAs diferencialment expressats (DE) entre porques en dejú i després de rebre aliment. Les xarxes de regulació gènica d’interaccions miRNA-mRNA van revelar mòduls de coexpressió de gens relacionats amb el metabolisme de lípids. A més, es va evidenciar la potencial influència de miRNAs DE en regular l’expressió de mRNAs amb funcions en el metabolisme de la glucosa i l’homeòstasi energètica.

La regulación del engrasamiento porcino y la calidad de la carne son aún poco conocidos. Inicialmente, investigamos la variabilidad de genes candidatos localizados en regiones QTL asociadas con caracteres de calidad de la carne y contenido y composición de grasa intramuscular. Identificamos polimorfismos en dichos genes candidatos a partir de datos de RNA-seq y secuencias de genoma completo (WGS) de cinco cerdos Duroc. El genotipo de ATP1A2 fue significativamente asociado a la conductividad eléctrica (CE) del músculo longissimus dorsi (LD) a nivel cromosómico. Nuestros resultados sugieren que el gen ATP1A2 puede estar involucrado en la regulación de la CE en el músculo. Por otra parte, hicimos uso de los datos de WGS para identificar mutaciones stop gained segregando en una población Duroc (Lipgen). Siete cerdos homocigotos para una mutación potencialmente letal en el gen ASS1 fueron identificados. Tras secuenciar dicha región a nivel genómico y transcriptómico, se reveló la presencia de una mutación inmediatamente antes, que eliminaría el codón de parada, generando un polimorfismo dinucleotídico que causa un cambio benigno de aminoácido en la secuencia de ASS1.

Seguidamente, utilizamos datos previos de expresión diferencial de RNA-seq para investigar la asociación de genes candidatos con caracteres de calidad de la carne. Dos polimorfismos localizados en los genes CRY2 y MIGA2 mostraron asociaciones significativas con el contenido de ácido esteárico en LD, y con la concentración de LDL en suero, respectivamente. Estos polimorfismos también fueron asociados con la expresión de sus respectivos genes. Análisis a nivel cromosómico mostraron que estos polimorfismos pueden no ser los SNPs causales. Además, analizamos los polimorfismos localizados en genes microRNA a partir de un total de 120 WGS de cerdos domésticos y salvajes de Asia y Europa. La variabilidad de regiones miRNA estuvo muy reducida en la seed comparado con otras regiones del miRNA y con el resto del genoma. Quince SNPs en genes miRNA fueron genotipados en la población Lipgen. Nuestros resultados revelaron, entre otros, una variante localizada en el bucle apical de ssc-miR-326 significativamente asociada con la expresión de algunos de sus mRNAs diana. Este SNP puede contribuir a la reestructuración del apareamiento de bases en la horquilla del miRNA, modificando la eficiencia de la maduración del propio miRNA.

Además, nos propusimos mejorar la aún limitada anotación del miRNAoma porcino mediante el desarrollo de un pipeline bioinformático para la identificación y anotación de genes miRNA. La fracción de RNA pequeño de 48 cerdas Duroc fue secuenciada para detectar miRNAs nuevos y ya conocidos. Los transcritos de datos de small RNA-seq y miRNAs maduros anotados en humano fueron cartografiados en el genoma porcino. Se realizó la reconstrucción de secuencias candidatas mediante la búsqueda de motivos nucleotídicos. Se obtuvieron un conjunto de parámetros de secuencia y termodinámicos de cada secuencia y se empleó un algoritmo de Machine Learning basado en grafos para predecir miRNAs, tanto nuevos como conocidos. Un total de 47 miRNAs porcinos putativos fueron detectados. La expresión de tres de ellos fue evaluada mediante técnicas de RT-qPCR y confirmada en una población independiente de cerdos de raza Göttingen minipig.

Finalmente se utilizaron los datos de small RNA-seq para determinar miRNAs diferencialmente expresados (DE) entre cerdas en ayunas y tras recibir alimento. Las redes de regulación génica de interacciones miRNA-mRNA relevaron módulos de co-expresión de genes relacionados con el metabolismo de lípidos. Además, se evidenció la potencial influencia de miRNAs DE en regular la expresión de mRNAs con funciones en el metabolismo de la glucosa y la homeostasis energética.

The genetic modulators of porcine fatness and meat quality traits, as well as their mechanisms of action, are still poorly understood. First, we investigated the variability of candidate genes located within QTL regions associated with meat quality traits and intramuscular fat content and composition. Polymorphic sites located at candidate genes were identified based on RNA-seq data and whole-genome sequencing of five Duroc boars. Significant association between ATP1A2 genotype and electric conductivity (CE) in the longissimus dorsi (LD) muscle, as well as in a chromosome-wide analysis, were revealed. Our results suggest that the ATP1A2 gene might be involved in the regulation of the CE of the skeletal muscle. Moreover, we employed whole-genome sequencing data from the five Duroc boars to identify putative stop gained mutations segregating in a Duroc population (Lipgen). Seven pigs homozygous for a potentially lethal nonsense recessive mutation in the ASS1 gene were detected. After sequencing such region at the genomic and transcriptomic levels, the presence of an additional polymorphism located immediately before the nonsense mutation that disrupts the stop codon was revealed, forming a dinucleotide polymorphism that causes a benign amino acid substitution in the ASS1 sequence.

Furthermore, we used previous RNA-seq differential expression data to investigate the association of candidate genes with meat quality traits. Two polymorphisms located in the CRY2 and MIGA2 genes showed significant associations with stearic acid content in LD and with LDL serum concentration, respectively. These SNPs were also associated with the mRNA levels of the corresponding genes. Joint chromosome-wide association analyses showed that these polymorphisms are not the ones showing the most significant associations. We also studied polymorphisms residing in microRNA genes. A total of 120 whole-genome sequences from European and Asian wild boars and domestic pigs were used for variant calling analyses, and polymorphisms within miRNA loci were investigated. Variability within miRNA loci was strongly reduced in the seed region compared with the rest of the miRNA sequence and other regions in the genome. Fifteen SNPs mapping to miRNA genes were genotyped in the Lipgen population. Our results revealed, among others, one variant located in the apical loop of ssc-miR-326 as significantly associated with the expression of some of its targets. This SNP might contribute to a structural rearrangement of the miRNA hairpin pairing, thus modifying the efficiency of the miRNA maturation.

Subsequently, we aimed to improve the yet poorly annotated porcine miRNAome by developing a bioinformatic pipeline for the discovery and annotation of miRNA genes. The small RNA fraction of 48 Duroc gilts was sequenced and used to detect novel and known expressed miRNAs. Small RNA-seq transcripts and annotated human mature miRNAs were mapped to the porcine genome. Reconstruction of candidate hairpin sequences was performed by applying a motif search correction approach. A series of sequence and thermodynamic features were obtained from each sequence and a Machine-Learning graph-based transductive algorithm was employed for predicting novel and annotated miRNA sequences. A total of 47 unreported putative porcine miRNAs were detected with this approach. The expression of three of the unreported miRNAs was assessed by using RT-qPCR analyses and their expression in an independent Göttingen minipig population was confirmed.

Finally, we employed the muscle small RNA-seq data set to determine differentially expressed (DE) miRNAs between fasting and fed pigs. Gene regulatory networks for miRNA-mRNA interactions highlighted co-expression modules containing lipid-related genes. The potential influence of several DE miRNAs in regulating the expression of mRNA genes with key roles in glucose metabolism and energy homeostasis was evidenced.