In vitro embryo production in goats by intracytoplasmic sperm injection (ICSI): gamete treatments

Abstract

El desenvolupament de la tècnica de microinjecció intracitoplasmàtica d’espermatozous (ICSI) va suposar un gran avanç per als laboratoris de reproducció assistida. Aquesta tècnica és de gran utilitat en casos d’infertilitat masculina, gàmetes criopreservats i ovòcits de baixa qualitat. Els oòcits de baixa qualitat són un dels principals factors que afecten negativament la producció d’embrions in vitro tant d’humans com en animals. En aquesta tesi utilitzem els ovòcits de cabra prepúber com a model d’estudi d’ovòcits de baixa qualitat per a: 1) Estudiar l’efecte de la criopreservació de gàmetes masculins i femenins (Estudis 1 i 2) sobre el desenvolupament embrionari després de la ICSI i 2) estudiar l’efecte de la suplementació amb un antioxidant natural, durant la maduració in vitro (MIV) dels oòcits, sobre el seu desenvolupament embrionari després de la ICSI. En el primer estudi comparem la utilització d’espermatozoides frescos i congelats per a la tècnica d’ICSI avaluant el seu efecte en el desenvolupament embrionari i la seva relació amb els paràmetres de capacitació dels espermatozoides. Els resultats van mostrar un nivell significativament més alt de capacitació en els espermatozoides congelats. No obstant això, aquestes diferències no es van traduir en diferències en formació pronuclear o desenvolupament embrionari després d’ICSI.

El segon estudi va examinar l’efecte de la vitrificació en oòcits de cabres prepúbers madurats in vitro en: el dany sobre els ovòcits avaluat mitjançant l’anàlisi de les espècies reactives d’oxigen (ROS) i el desenvolupament embrionari amb ICSI i l’activació partenogenètica (AP). Els resultats van mostrar que el grup dels ovòcits vitrificats tenien nivells de ROS més alts en comparació amb els ovòcits no vitrificats. Després de la ICSI la formació normal de zigots i de blastocists no presentava diferències entre els dos grups. No obstant això, després d’AP, la divisió dels ovòcits i la formació de blastocists van disminuir significativament després de la vitrificació. L’estudi 3 va tenir com a objectiu millorar la competència dels oòcits de cabres prepúbers suplementant el medi de maduració amb crocetina, un antioxidant natural. Vam avaluar l’efecte de la crocetina sobre paràmetres moleculars i cel·lulars relacionats amb la competència dels ovòcits (ROS, glutatió (GSH) i activitat mitocondrial) i el desenvolupament embrionari després de fecundació in vitro (FIV), ICSI, i AP. No es van observar diferències significatives en la formació de blastocists entre les diferents concentracions de crocetina 0 µM (control), 0.5 µM, 1 µM i 2 µM després de la FIV. No obstant això, vam demostrar que una concentració de 1 µM de crocetina en el medi de maduració va reduir significativament els nivells de ROS encara que no va modificar la concentració de GSH o l’activitat mitocondrial. Analitzant l’efecte de la crocetina sobre el desenvolupament embrionari després de la ICSI i l’AP no vam observar cap diferència estadísticament significativa en el percentatge de divisió dels ovòcits, la formació de blastocists o el nombre total de cèl·lules per blastòcit entre els grups. No obstant això, en el grup d’ICSI amb crocetina vam observar lleugeres millores com una major divisió dels ovòcits i major formació de blastocists que en els oòcits madurats sense antioxidant. En conclusió, en aquesta tesi vam demostrar que el semen congelat pot ser tan eficient com el semen fresc per produir embrions de oòcits de cabres prepúbers mitjançant ICSI. No obstant això, amb el protocol utilitzat, els oòcits de cabres prepúbers després de la vitrificació no es van poder desenvolupar fins a blastocist després de ser fertilitzats per ICSI. L’addició d’un antioxidant com la crocetina al medi de maduració redueix significativament els nivells de ROS, i pot millorar lleugerament el desenvolupament embrionari després d’ICSI.

El desarrollo de la técnica de microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) supuso un gran avance para los laboratorios de reproducción asistida. Esta técnica es de gran utilidad en casos de infertilidad masculina, gametos criopreservados y ovocitos de baja calidad. Los ovocitos de baja calidad son uno de los principales factores que afectan negativamente la producción de embriones in vitro (PIVE) tanto de humanos como en animales. En esta tesis utilizamos los ovocitos de cabra prepúber como modelo de estudio de ovocitos de baja calidad para: 1) Estudiar el efecto de la criopreservación de gametos masculinos y femeninos (Estudios 1 y 2) sobre el desarrollo embrionario después de la ICSI y 2) Estudiar el efecto de la suplementación con un antioxidante natural, durante la maduración in vitro (MIV) de los ovocitos, sobre su desarrollo embrionario después de la ICSI. En el primer estudio comparamos la utilización de espermatozoides frescos y congelados para la técnica de ICSI evaluando su efecto en el desarrollo embrionario y su relación con los parámetros de capacitación de los espermatozoides. Los resultados mostraron un nivel significativamente más alto de capacitación en los espermatozoides congelados. Sin embargo, estas diferencias no se tradujeron en diferencias en formación pronuclear o desarrollo embrionario después de ICSI. El segundo estudio examinamos el efecto de la vitrificación en ovocitos de cabras prepúberes madurados in vitro en: el daño sobre los ovocitos evaluado mediante el análisis de las especies reactivas de oxigeno (ROS) y el desarrollo embrionario con ICSI y activación partenogenética (AP). Los resultados mostraron que el grupo de los ovocitos vitrificados tenían niveles de ROS más altos comparación con los ovocitos no vitrificados. Después de la ICSI la formación normal de cigotos y de blastocistos no presentaba diferencias entre ambos grupos. Sin embargo, después de AP, la división de los ovocitos y la formación de blastocistos disminuyeron significativamente tras la vitrificación. El estudio 3 tuvo como objetivo mejorar la competencia de los ovocitos de cabras prepúberes suplementando el medio de maduración con crocetina, un antioxidante natural. Evaluamos el efecto de la crocetina sobre parámetros moleculares y celulares relacionados con la competencia de los ovocitos (ROS, glutatión (GSH) y actividad mitocondrial) y el desarrollo embrionario después de fecundación in vitro (FIV), ICSI, y AP. No se observaron diferencias significativas en la formación de blastocistos entre las distintas concentraciones de crocetina 0 µM (control), 0.5 µM, 1 µM y 2 µM después de la FIV. Sin embargo, demostramos que una concentración de 1 µM de crocetina en el medio de maduración reduce significativamente los niveles de ROS aunque no modificó la concentración de GSH o la actividad mitocondrial. Analizando el efecto de la crocetina sobre el desarrollo embrionario después de la ICSI y la AP no observamos ninguna diferencia estadísticamente significativa en el porcentaje de división de los ovocitos, la formación de blastocistos o el número total de células por blastocisto entre los grupos. Sin embargo, en el grupo de ICSI con crocetina se observaron ligeras mejoras como una mayor división de los ovocitos y mayor formación de blastocistos que en los ovocitos madurados sin antioxidante. En conclusión, en este estudio hemos demostrado que el semen congelado puede ser tan eficiente como el semen fresco para producir embriones de ovocitos de cabras prepúberes mediante ICSI. Sin embargo, con el protocolo utilizado, los ovocitos de cabras prepúberes después de la vitrificación no pudieron desarrollarse hasta blastocisto después de ser fertilizados por ICSI. La adición de un antioxidante como la crocetina al medio de maduración reduce significativamente los niveles de ROS, y puede mejorar ligeramente el desarrollo embrionario después de ICSI.

The development of the intracytoplasmic sperm microinjection technique (ICSI) was a great advance for assisted reproduction laboratories. This technique is very useful in cases of male infertility, cryopreserved gametes and low-quality oocytes. Low-quality oocytes are one of the main factors that negatively affect in vitro embryo production (IVEP) in both humans and animals. In this thesis we use prepubertal goat oocytes as a study model for low-quality oocytes to: 1) Study the effect of cryopreservation of male and female games (Studies 1 and 2) on embryonic development after ICSI and 2) To study the effect of supplementation with a natural antioxidant called Crocetin, during in vitro maturation (IVM) of oocytes, on their embryonic development after ICSI.

In study 1, we compared the use of fresh and frozen sperm for the ICSI technique, evaluating its effect on embryonic development and its relationship with sperm capacitation parameters. The results showed significantly higher level of capacitated spermatozoa in frozen-thawed sample. However, these differences were not translated into differences in pronuclear formation or embryonic development after ICSI between groups.

The second study examined the effect of vitrification on IVM prepubertal goat oocytes on: damage to oocytes assessed by analysis of reactive oxygen species (ROS) and embryonic development with ICSI and parthenogenetic activation (PA). The results showed that the group of vitrified oocytes had higher ROS levels compared to non-vitrified oocytes. After ICSI, the normal formation of zygotes and blastocysts did not show differences between both groups. However, after PA, oocyte division and blastocyst formation decreased significantly with vitrification process.

Study 3 was aimed at improving the competence of prepubertal goat oocytes by supplementing the maturing medium with crocetin, a natural antioxidant. We evaluated the effect of crocetin on molecular and cellular parameters related to oocyte competence (ROS, glutathione (GSH) and mitochondrial activity) and embryonic development after in vitro fertilization (IVF), ICSI, and PA. No significant difference in blastocyst formation was observed between the different concentrations of crocetin 0 µM (control), 0.5 µM, 1 µM and 2 µM after IVF. However, we demonstrate that a 1 µM concentration of crocetin in the maturation medium significantly reduced ROS levels although it did not modify the GSH concentration or mitochondrial activity. Analyzing the effect of crocetin on embryonic development after ICSI and PA, we did not observe any statistically significant difference in the percentage of oocyte division, blastocyst formation or the total number of cells per blastocyst between groups. However, slight improvements such as increased oocyte division and greater blastocyst formation were observed in the crocetin ICSI group whose oocytes where matured with 1 µM crocetin.

In conclusion, we have demonstrated that fresh and frozen-thawed semen can be useful for ICSI of prepubertal goat oocytes without compromising the results. However, with the protocol used, prepubertal goat oocytes after vitrification were not able to develop up to blastocyst after being fertilized by ICSI. The crocetin addition to IVM has not shown significant effects on embryo production from prepubertal goat oocytes in spite of the significant reduction on ROS level and slightly improvement on embryo development after ICSI.