When oncology meets immunology: improving GL261 glioblastoma treatment through cancer-related immunity and MRSI-based non-invasive follow-up of response

Abstract

Els Glioblastomes (GB) son tumors cerebrals invasius, amb mal pronòstic i resposta pobra a la teràpia. Aquesta tesi pretén millorar el tractament del GB preclínic mitjançant la immunitat relacionada amb el càncer i el seguiment no invasiu de la resposta amb Imatge Espectroscòpica de Ressonància Magnètica (IERM). El model de GB GL261 ha estat escollit per ser immunocompetent i adequat per a estudis de teràpia. S’ han investigat tres estratègies terapèutiques: a) quimioteràpia (Temozolamida, TMZ), en protocol metronòmic respectuós amb el sistema immune (Immune-Enhancing Metronomic Schedule, IMS-TMZ), b) un inhibidor de punt de control immunològic (Programmed cell death protein 1, anticòs anti-PD-1), i c) combinació de TMZ+anti-PD-1 en IMS. Diferents tipus de dany cel·lular desencadenats per la teràpia estimulen la resposta immune anti-càncer. El nostre objectiu ha estat, per una banda, induir dany cel·lular immunogènic, preservant les cèl·lules del sistema immune (IMS-TMZ). Per altra banda, contrarestar la immunosupressió al tumor (anti-PD-1). El protocol de IMS-TMZ ha millorat la supervivència dels ratolins amb GB GL261, sobrepassant resultats previs del grup. La teràpia amb anti-PD-1 ha estat efectiva en dosis elevades (500/250 μg), tot i que diferències al volum tumoral a l’ inici de la immunoteràpia impacten en la seva eficàcia. La teràpia combinada anti-PD-1+TMZ en IMS ha resultat millor que les teràpies per separat. Aquests resultats recolzen la participació del sistema immune en la resposta a la teràpia en GB. Estudis del nostre grup amb imatges nosològiques basades en IERM apunten a que els canvis al patró metabolòmic estarien relacionats amb l’ acció del sistema immune sobre els tumors, actuant com marcador vicari de resposta a la teràpia. Ens hem preguntat si els mateixos canvis metabolòmics s’ apreciarien si aquest sistema s’ apliqués a estratègies d’ immunoteràpia. S’ ha seguit amb aquest sistema l’ evolució de ratolins amb tumors GL261 tractats amb IMS-TMZ, IMS-anti-PD-1 i IMS-anti-PD-1/TMZ. El protocol de IMS-TMZ produeix oscil·lació de canvis al patró metabolòmic, amb freqüència de 6 dies. Aquest comportament s’ ha confirmat en ratolins tractats amb immunoteràpia, sola o en combinació, suggerint que els canvis al patró metabolòmic son comuns a diferents estratègies terapèutiques, sempre que hi hagi estímul i atracció del sistema immune amb atac productiu a les cèl·lules tumorals. Això obre camí per l’ ús traslacional del biomarcador basat en MRSI en la teràpia personalitzada en pacients de GB, incloent l’ immunoteràpia, per la qual encara no es disposa de biomarcadors no invasius fiables. La participació del sistema immune també es veu recolzada pel percentatge d’ animals curats observats en aquesta tesi (50-100% depenent de la teràpia), els quals han presentat memòria immune contra subsegüents intents de generació del mateix tipus de tumor.

La resistència a TMZ es una de las causes del fracàs de la quimioteràpia adjuvant en el tractament de GB. Hem investigat el rol de la O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) y programmed death-ligand 1 (PD-L1) en la quimioresistència, utilitzant western-blot, en tumors que escapen a la teràpia IMS-TMZ després de presentar resposta transitòria. L’ expressió de PD-L1 es triplica en aquests tumors en comparació amb controls, indicant que aquests nivells podrien ser rellevants en la resistència a la TMZ in vivo, tenint la teràpia anti-PD-1 potencial per a ‘rescatar’ tumors escapant de la teràpia amb TMZ. La combinació d’ oncologia i immunologia pot obrir camí cap a una millora de l’ eficàcia de la teràpia i dels resultats obtinguts amb els pacients de GB.

Los Glioblastomas (GB) son tumores cerebrales invasivos, con mal pronóstico y respuesta pobre a la terapia. Esta tesis pretende mejorar el tratamiento del GB preclínico utilizando la inmunidad relacionada con el cáncer y el seguimiento no invasivo de la respuesta mediante Imagen Espectroscópica de Resonancia Magnética (IERM). El modelo de GB GL261 fue escogido por ser inmunocompetente y adecuado para estudios de terapia. Se investigaron tres estrategias terapéuticas: a) quimioterapia (Temozolamida, TMZ), en protocolo metronómico respetuoso con el sistema inmune (Immune-Enhancing Metronomic Schedule, IMS-TMZ), b) un inhibidor de punto de control inmunológico (Programmed cell death protein 1, anticuerpo anti-PD-1), y c) combinación de TMZ+anti-PD-1 en IMS. Diferentes tipos de daño celular desencadenados por la terapia estimulan la respuesta inmune anti-cáncer. Nuestro objetivo fue, por un lado, inducir daño celular inmunogénico, preservando las células del sistema inmune (IMS-TMZ). Por otro lado, contrarrestar la inmunosupresión en el tumor (anti-PD-1). El protocolo de IMS-TMZ ha mejorado la supervivencia de los ratones con GB GL261, sobrepasando resultados previos del grupo. La terapia con anti-PD-1 fue efectiva en doses elevadas (500/250 μg), aunque diferencias en el volumen tumoral al inicio de la inmunoterapia impactan en su eficacia. La terapia combinada anti-PD-1+TMZ en IMS ha resultado mejor que las terapias por separado. Estos resultados respaldan la participación del sistema inmune en la respuesta a la terapia en GB. Estudios de nuestro grupo con imágenes nosológicas basadas en IERM apuntan a que los cambios en el patrón metabolómico estarían relacionados con la acción del sistema inmune sobre los tumores, actuando como marcador subrogado de respuesta a la terapia. Nos hemos preguntado si los mismos cambios metabolómicos se apreciarían si este sistema fuese aplicado a estrategias de inmunoterapia. Se siguió con dicho sistema la evolución de ratones con tumores GL261 tratados con IMS-TMZ, IMS-anti-PD-1 e IMS-anti-PD-1/TMZ. El protocolo de IMS-TMZ produce oscilación de cambios en el patrón metabolómico, con una frecuencia de 6 días. Dicho comportamiento se ha confirmado en ratones tratados con inmunoterapia, sola o en combinación, sugiriendo que los cambios en el patrón metabolómico son comunes a distintas estrategias terapéuticas, siempre que haya estímulo y atracción del sistema inmune con ataque productivo a las células tumorales. Ello abre el camino para un uso traslacional del biomarcador basado en MRSI para terapia personalizada en pacientes de GB, incluyendo inmunoterapia, para la cual aún no se dispone de biomarcadores no invasivos fiables. La participación del sistema inmune también es respaldada por el porcentaje de animales curados observados en esta tesis (50-100% dependiendo de la terapia), los cuales presentaron memoria inmune contra subsecuentes intentos de generación del mismo tipo de tumor.

La resistencia a TMZ es una de las causas del fracaso de la quimioterapia adyuvante en el tratamiento de GB. Hemos investigado el papel de la O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) y programmed death-ligand 1 (PD-L1) en la quimioresistencia, utilizando western-blot, en tumores que escapan a la terapia IMS-TMZ después de presentar respuesta transitoria. La expresión de PD-L1 se triplica en esos tumores en comparación con controles, indicando que dichos niveles podrían ser relevantes en la resistencia a la TMZ in vivo, teniendo la terapia anti-PD-1 potencial para ‘rescatar’ tumores escapando de la terapia con TMZ. La combinación de oncología e inmunología guiará el camino para una mejorar tanto la eficacia de la terapia como los resultados obtenidos con pacientes de GB.

Glioblastomas (GB) are invasive brain tumours associated with poor prognosis and limited response to therapy. This thesis focused in improving preclinical GB treatment through cancer-related immunity and Magnetic Resonance Spectroscopic Imaging (MRSI)-based non-invasive response follow-up. The GL261 GB was chosen since it is an immunocompetent preclinical model suitable for studying therapies. Three therapeutic strategies have been tested: a) chemotherapy (Temozolomide, TMZ), administered in an Immune-Enhancing Metronomic Schedule (IMS-TMZ), b) immune checkpoint inhibitor (Programmed cell death protein 1, PD-1 antibody) and c) IMS-anti-PD-1/TMZ combination therapy. Anti-tumour immune responses can be stimulated by therapies targeting different aspects of cell damage. We aimed, on one hand, to induce immunogenic tumour cell damage while sparing replicating immune system cells (with IMS-TMZ). On the other hand, we wanted to counteract the immune suppression within the tumour (anti-PD-1 immunotherapy). IMS-TMZ significantly improved survival in GL261 GB-bearing mice in comparison with standard TMZ treatment, confirming and surpassing results reported by our group. Anti-PD-1 monotherapy was effective when applied at high dose (500/250 μg), although care should be taken since results suggest that differences in tumour volume at immunotherapy starting time can have great impact in its efficacy. As expected, the IMS-anti-PD-1/TMZ combination therapy showed a great beneficial effect, with much better therapeutic outcome than monotherapies administration. These results support the fact that the host immune system is clearly involved in GB response processes. Previous studies from our group with MRSI-based nosological images pointed that the metabolomic pattern changes could be linked to host immune system local effects onto tumours, acting as a surrogate biomarker of therapy response. Accordingly, we wondered whether the application of this non-invasive MRSI approach in evaluating immunotherapeutic strategies would reflect the same type of metabolomics changes. Thus, the evolution of GL261-tumor bearing mice treated with IMS-TMZ, IMS-anti-PD-1 and IMS-anti-PD-1/TMZ was evaluated using the same MRSI-based nosological images approach. Results confirmed that the IMS-TMZ protocol consistently produced the expected oscillatory changes in the MRSI metabolomics pattern, with a frequency of ca. 6 days. This oscillatory behaviour was also confirmed in mice treated with immunotherapy both in combination with TMZ and as monotherapy, hinting that the observed spectral pattern changes observed during therapy response are shared by different therapeutic strategies, provided the host immune system is elicited and is able to productively attack tumour cells. This opens the way for a translational use of the MRSI-based biomarker for patient-tailored GB therapy, including immunotherapy, for which reliable non-invasive biomarkers are still missing. The participation of immune system is also supported by the rate of cured animals observed in this thesis (range 50 - 100 % depending on the treatment), which also held long-term immune memory against tumour cell re-challenge.

Resistance to TMZ treatment is one of the main reasons for the chemotherapy failure in adjuvant treatment of GB. We investigated the relevance of O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) and programmed death-ligand 1 (PD-L1) content in chemoresistance, by western-blot (WB) analysis, with special focus on tumours escaping therapy after transient response. Result showed a 3-fold increase in PD-L1 expression in IMS-TMZ relapsing tumours in comparison with control tumours, indicating that PD-L1 can be involved in TMZ resistance for GL261 GB in vivo. Accordingly, anti-PD1 therapy may have potential to ‘rescue’ tumours escaping from TMZ therapy. Appropriate combination of oncology and immunology will pave the way for improving GB treatment and patient outcome.