Study of urine extracellular vesicles-derived protein biomarkers for the non-invasive monitoring of kidney-transplanted patients

Abstract

El rebuig crònic en el trasplantament renal és la causa principal de fallada de l’empelt. Donat que la biòpsia renal (l’actual mètode diagnòstic considerat com a el ‘gold standard’) és invasiva, costosa, implica una alta subjectivitat i no és representativa de tot el ronyó, hi ha una necessitat clara de desenvolupar testos diagnòstics no invasius i rendibles. Per cobrir aquesta necessitat, en aquesta tesis ens vam proposar com a objectiu trobar biomarcadors proteics que es puguin utilitzar com a un mètode diagnòstic no invasiu d’alteracions renals en pacients trasplantats de ronyó.

L’orina s’ha investigat extensament buscant biomarcadors de diverses alteracions renals en el context del trasplantament perquè proporciona una visió holística de tot el sistema urinari. A més, es pot mostrejar de manera no invasiva i repetidament. No obstant, els complexos constituents de l’orina poden dificultar la detecció de proteïnes menys abundants mitjançant tècniques de proteòmica. En aquest sentit, l’anàlisi de vesícules extracel·lulars (VE) presents en l’orina profereix una solució atractiva. Degut al fet que la composició de VE varia segons l’estat fisiològic i l’origen de la cèl·lula productora, les VE urinàries (uVE) són una font ideal de biomarcadors urinaris.

La introducció de la tesis conté una breu història del ronyó i del trasplantament de ronyó que, malgrat que poden ser interesants pel lector, no és necessari per poder comprendre els resultats. La introducció ‘formal’ se centra en l’epidemiologia del trasplantament renal, els tipus de rebuig, els mètodes diagnòstics actuals i defineix els problemes a solucionar. Els resultats i discussió del projecte s’han dividit en tres parts basats en l’estructura d’articles publicats, amb algunes modificacions per acomodar-ho a l’estructura d’una tesi doctoral.

L’estudi exposat en aquesta tesi segueix un sistema comú en la recerca de biomarcadors proteics, que consisteix en una fase de descobriment, una fase de verificació i una fase de validació. En cada fase, vam analitzar el proteoma de les uVE de pacients trasplantats de ronyó utilitzant espectrometria de masses (EM) o tècniques basades en anticossos. Els pacients van ser classificats en quatre grups segons l’alteració renal que patien, diagnosticada a partir de biòpsia renal i paràmetres clínics (sigles segons terminologia anglesa): funció renal normal (NKF), fibrosi intersticial i atròfia tubular (IFTA), toxicitat per inhibidors de la calcineurina (CNIT) i rebuig cel·lular agut (ACR).

La primera part es focalitza en la CNIT, els mecanismes de la qual estan poc caracteritzats, així com també el seu diagnosis i tractament. Els resultats van mostrar que hi havia una major regulació de proteïnes relacionades amb processos epitelials, de uroplaquines i plaquines en les uVE de CNIT, el que suggereix la participació d’aquestes proteïnes en la CNIT específicament però no en el desenvolupament de lesions fibròtiques.

A la segona part es descriuen altres proteïnes diferencialment expressades en mostres patològiques en comparació amb el grup NKF trobades en la fase de descobriment. Vam procedir amb una segona fase (fase de verificació) mitjançant proteòmica dirigida en una cohort de pacients més gran. Entre altres troballes, la vitronectina es va trobar més expressada en pacients amb un alt grau de fibrosi renal (definida segons paràmetres histològics de Banff), assenyalant el potencial d’aquesta proteïna com a biomarcadors de fibrosi renal.

Finalment, a la tercera part, vam dur a terme un estudi pilot per demostrar la detecció de vitronectina segons el grau de fibrosi renal utilitzant un assaig d’ELISA. Amb aquest mètode, molt més rendible que l’EM, aconseguim apropar les troballes del projecte a la pràctica clínica.

El rechazo crónico en el trasplante renal es la causa principal de fallo del injerto. Dado que la biopsia renal (el actual método diagnóstico considerado como el ""gold standard"") es invasiva, costosa, implica una alta subjetividad y no es representativa de todo el riñón, hay una necesidad clara de desarrollar macetas diagnósticos no invasivos y rentables. Para cubrir esta necesidad, en esta tesis nos propusimos como objetivo encontrar biomarcadores proteicos que se puedan utilizar como un método diagnóstico no invasivo de alteraciones renales en pacientes trasplantados de riñón.

La orina se ha investigado extensamente buscando biomarcadores de diversas alteraciones renales en el contexto del trasplante porque proporciona una visión holística de todo el sistema urinario. Además, se puede muestrear de manera no invasiva y repetidamente. Sin embargo, los complejos constituyentes de la orina pueden dificultar la detección de proteínas menos abundantes mediante técnicas de proteómica. En este sentido, el análisis de vesículas extracelulares (VE) presentes en la orina profiere una solución atractiva. Debido a que la composición de VE varía según el estado fisiológico y el origen de la célula productora, las VE urinarias (UVE) son una fuente ideal de biomarcadores urinarios.

La introducción de la tesis contiene una breve historia del riñón y del trasplante de riñón que, a pesar de que pueden ser interesantes para el lector, no es necesario para poder comprender los resultados. La introducción ""formal"" se centra en la epidemiología del trasplante renal, los tipos de rechazo, los métodos diagnósticos actuales y define los problemas a solucionar. Los resultados y discusión del proyecto se han dividido en tres partes basados ​​en la estructura de artículos publicados, con algunas modificaciones para acomodarlo a la estructura de una tesis doctoral.

El estudio expuesto en esta tesis sigue un sistema común en la búsqueda de biomarcadores proteicos, que consiste en una fase de descubrimiento, una fase de verificación y una fase de validación. En cada fase, analizamos el proteoma de las UVE de pacientes trasplantados de riñón utilizando espectrometría de masas (EM) o técnicas basadas en anticuerpos. Los pacientes fueron clasificados en cuatro grupos según la alteración renal que sufrían, diagnosticada a partir de biopsia renal y parámetros clínicos (siglas según terminología inglesa): función renal normal (NKF), fibrosis intersticial y atrofia tubular (IFTA), toxicidad por inhibidores de la calcineurina (CNIT) y rechazo celular agudo (ACR).

La primera parte se focaliza en la CNIT, los mecanismos de la que están poco caracterizados, así como también su diagnosis y tratamiento. Los resultados mostraron que había una mayor regulación de proteínas relacionadas con procesos epiteliales, de uroplaquines y plaquines en las UVE de CNIT, lo que sugiere la participación de estas proteínas en la CNIT específicamente pero no en el desarrollo de lesiones fibróticas.

En la segunda parte se describen otras proteínas diferencialmente expresadas en muestras patológicas en comparación con el grupo NKF encontradas en la fase de descubrimiento. Procedimos con una segunda fase (fase de verificación) mediante proteómica dirigida en una cohorte de pacientes mayor. Entre otros hallazgos, la vitronectina se encontró más expresada en pacientes con un alto grado de fibrosis renal (definida según parámetros histológicos de Banff), señalando el potencial de esta proteína como biomarcadores de fibrosis renal.

Finalmente, en la tercera parte, llevamos a cabo un estudio piloto para demostrar la detección de vitronectina según el grado de fibrosis renal utilizando un ensayo de ELISA. Con este método, mucho más rentable que la EM, conseguimos acercar los hallazgos del proyecto a la práctica clínica.

Chronic rejection in kidney transplantation is the main cause of graft failure. Since renal biopsy -the current gold standard diagnostic method- is invasive, costly, entails a high subjectivity factor and is not representative of the whole kidney, there is a clear need for more precise, non-invasive and cost-effective diagnosis tests. To meet this need, the objective of this thesis was to find protein biomarkers that could be utilized as a non-invasive diagnosis method of renal alterations in kidney-transplanted patients.

Urine has been extensively investigated to find biomarkers of different renal alterations in kidney transplantation because it provides a holistic view of the whole urinary system, and it can be collected non-invasively, and repeatedly. However, the complex constituents of urine can hamper the detection of lower abundant proteins by proteomic technologies. In this sense, the analysis of extracellular vesicles (EV) found in urine provides an attractive solution. Since the composition of EV varies upon the origin and physiological state of the producing cell, urinary EV (uEV) are an ideal source of biomarkers for renal alterations. Moreover, high abundance contaminant proteins are usually removed during the isolation process, while the protein cargo of uEV remains protected.

The introduction of the thesis contains a brief history of the kidney and kidney transplantation, which although interesting for the reader, it is not strictly relevant for the comprehension of the results. The 'formal' introduction focuses on the epidemiology of kidney transplantation, types of graft rejection, current diagnosis methods and defines the problem to solve. The results and discussion of the project were divided into three parts based on the structure of published articles, with some modifications to accommodate to the structure of a doctoral thesis.

The study exposed in this thesis follows a common pipeline for protein biomarker search, consisting of a discovery phase, a verification phase and a validation phase. In each phase, we analysed the uEV proteome from kidney-transplanted patients using mass-spectrometry (MS) or antibody-based techniques. Patients were classified into four groups according to their renal alteration diagnosed by biopsy and clinical parameters: normal kidney function (NKF), interstitial fibrosis and tubular atrophy (IFTA), calcineurin inhibitors toxicity (CNIT) and acute cellular rejection (ACR).

The first part is focused on CNIT, a kidney alteration of poorly characterized mechanisms, diagnosis and treatment. Although in kidney biopsy CNIT often shows IFTA lesions, the treatment is consistently different. We scanned the CNIT uEV proteome by MS searching for differences with IFTA group that could reveal potential biomarkers of CNI nephrotoxicity. The results showed upregulation of terms related to epithelial processes and overexpression of uroplakins and plakins in the CNIT group uEV, suggesting the participation of these proteins specifically in CNIT, but not in the development of fibrotic lesions.

In the second part, we expose other proteins differentially expressed in pathological samples compared to NKF patients found in the discovery phase. Then, a second phase (verification phase) was set up using targeted MS in a bigger cohort of patients to confirm the results of the candidate proteins selected from the first phase. Among other findings, vitronectin was found to be more expressed in patients with high degree of kidney fibrosis (defined by Banff histological criteria), pointing out the potential of this protein as a biomarker for renal fibrosis.

Finally, in the third part, we carried out a pilot study to demonstrate the detection of urinary vitronectin using ELISA. With this method, much more cost-efficient than MS, we can make the findings in this project more translationable to the clinical practice.