Multidisciplinary approach for recombinant protein production bioprocess design with classic and novel expression systems in Pichia pastoris

Abstract

La present tesi doctoral es centra en la caracterització de sistemes d’expressió utilitzats per a la producció de proteïnes recombinants (RPP) en el llevat metilotròfic Pichia pastoris. Al llarg de tot aquest treball s’integren els resultats de diferents camps -enginyeria de bioprocessos i regulació génica- per tal d’ampliar la informació sobre els sistemes d’expressió analitzats i, així, reduir la incertesa a l’dissenyar un bioprocés RPP.

En el primer capítol de la tesi, s’estudia el sistema clàssic d’expressió basat en el PAOX1. En un primer pas, es van cultivar en quimiòstat dos clons productors de la Lipasa 1 de Candida rugosa (Cr1l) amb diferent dosi gènica. D’aquesta manera, es va determinar la interrelació de tres factors importants en els bioprocessos RPP com ara la velocitat específica de creixement (μ), els nivells d’expressió relativa de el gen heteròleg (RTL) i la velocitat específica de generació de producte (qp) . A més, també es va monitoritzar l’expressió d’un factor de transcripció important per a la via d’utilització de metanol (MIT1). Un cop establertes les condicions òptimes d’operació en continu, es van dur a terme cultius en fed-batch per validar i comparar el comportament dels clons productors observat, tant des del punt de vista del seu estat fisiològic com de la cinètica de producció de Crl1 .

Els inconvenients de l’ús de el potent sistema d’expressió basat en PAOX1-principalment derivat de l’ús de l’metanol com a font de carboni, font d’electrons i inductor de RPP- han portat a la comunitat de Pichia a investigar i desenvolupar sistemes d’expressió alternatius que no depenguin de l’addició de metanol. A causa d’això, en el segon capítol de la tesi, es van caracteritzar dos nous sistemes d’expressió, basats en el PPDF i PUPP, per determinar si poden competir amb l’àmpliament utilitzat PGAP en la producció de la Lipasa B de Candida antarctica (Calb) . El comportament dels tres sistemes d’expressió es va comparar, en primer lloc, en quimiòstat. Això va permetre obtenir informació sobre la influència de la μ i l’expressió de Calb en la cinètica de producció de la proteïna. A més, els clons productors de la proteïna recombinant sota els nous sistemes d’expressió es van cultivar a fed-batch, en les condicions òptimes observades prèviament, per tal de provar la potencial escalabilitat del bioprocés.

En l’últim capítol de la tesi es va optimitzar, utilitzant cèl·lules senceres de P. pastoris (whole cells), la producció del citrocromo P450 2C9 humà (CYP2C9). La coexpressió d’aquest enzim d’interès industrial al costat del domini donador d’electrons (cytochrome P450 reductase, CPR) es va realitzar mitjançant un nou sistema de promotors bidireccionals. Després d’una fase de screening en la qual es van provar fins a 8 promotors per a la producció de CYP2C9 / CPR, es va seleccionar la combinació que va proporcionar la major activitat oxidasa, i es van realitzar una sèrie de cultius per optimitzar el bioprocés. D’aquesta manera, es va determinar la influència de paràmetres importants de l’bioprocés -μ, pH i estratègia d’addició de metanol en la producció de biocatalizador. Finalment, l’eficiència de l’biocatalizador obtingut es va testar en la reacció de hidroxilació de l’ibuprofèn.

La presente tesis doctoral se centra en la caracterización de sistemas de expresión utilizados para la producción de proteínas recombinantes (RPP) en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. A lo largo de todo este trabajo se integran los resultados de diferentes campos —ingeniería de bioprocesos y regulación génica— con el fin de ampliar la información sobre los sistemas de expresión analizados y, así, reducir la incertidumbre al diseñar un bioproceso RPP.

En el primer capítulo de la tesis, se estudia el sistema clásico de expresión basado en el PAOX1. En un primer paso, se cultivaron en quimiostato dos clones productores de la Lipasa 1 de Candida rugosa (Cr1l) con diferente dosis génica. De esta manera, se determinó la interrelación de tres factores importantes en los bioprocesos de RPP tales como la velocidad específica de crecimiento (µ), los niveles de expresión relativa del gen heterólogo (RTL) y la velocidad específica de generación de producto (qp). Además, también se monitorizó la expresión de un factor de transcripción importante para la vía de utilización del metanol (MIT1). Una vez establecidas las condiciones óptimas de operación en continuo, se llevaron a cabo cultivos en fed-batch para validar y comparar el comportamiento de los clones productores observado, tanto desde el punto de vista de su estado fisiológico como de la cinética de producción de Crl1.

Los inconvenientes del uso del potente sistema de expresión basado en PAOX1—principalmente derivado del uso del metanol como fuente de carbono, fuente de electrones e inductor de RPP— han llevado a la comunidad de Pichia a investigar y desarrollar sistemas de expresión alternativos que no dependan de la adición de metanol. Debido a ello, en el segundo capítulo de la tesis, se caracterizaron dos nuevos sistemas de expresión, basados en el PPDF y PUPP, para determinar si pueden competir con el ampliamente utilizado PGAP en la producción de la Lipasa B de Candida antarctica (CalB). El comportamiento de los tres sistemas de expresión se comparó, en primer lugar, en quimiostato. Esto permitió obtener información sobre la influencia de la µ y la expresión de CALB en la cinética de producción de la proteína. Además, los clones productores de la proteína recombinante bajo los nuevos sistemas de expresión se cultivaron en fed-batch, en las condiciones óptimas observadas previamente, con el fin de probar la potencial escalabilidad del bioproceso.

En el último capítulo de la tesis se optimizó, utilizando células enteras de P. pastoris (whole cells), la producción del citrocromo P450 2C9 humano (CYP2C9). La coexpresión de esta enzima de interés industrial junto al dominio donador de electrones (cytochrome P450 reductase, CPR) se realizó mediante un novedoso sistema de promotores bidireccionales. Después de una fase de screening en la que se probaron hasta 8 promotores para la producción de CYP2C9/CPR, se seleccionó la combinación que proporcionó la mayor actividad oxidasa, y se realizaron una serie de cultivos para optimizar el bioproceso. De este modo, se determinó la influencia de parámetros importantes del bioproceso —µ, pH y estrategia de adición de metanol— en la producción de biocatalizador. Finalmente, la eficiencia del biocatalizador obtenido se testó en la reacción de hidroxilación del ibuprofeno.

The present thesis is focused on the characterization of alternative expression systems used for recombinant protein production (RPP) in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Over this whole work, the integration of results from different fields —bioprocess engineering and gene regulation— is attempted in order to fill the gaps that frequently come up when designing a RPP bioprocess.

In the first chapter of the thesis, the classical PAOX1-based expression system is thoroughly studied. Specifically, through a set of chemostat cultivations of two clones expressing the Candida rugosa lipase 1 (Cr1l) with different gene dosage, it was determined the interrelation of three important factors in RPP processes such as specific growth rate (µ), heterologous gene relative transcript levels (RTL) and specific product generation rate (qp). Moreover, the expression of a crucial transcription factor of the methanol utilization pathway (MIT1) was also determined in chemostat cultivations. Once the optimal operation conditions were identified in steady state conditions, fed-batch cultivations were conducted to validate the clones’ behaviour observed previously in terms of both physiological state and Crl1 production kinetics.

The inherent drawbacks of using the powerful PAOX1-based expression system —mainly derived from the use of methanol as carbon source, electron source and RPP inducer— has forced the Pichia community to investigate and develop alternative methanol-free expression systems. Due to that, in the second chapter of the thesis, two novel expression systems, based on the PPDF and PUPP, were similarly characterized in order to determine whether they can compete in terms of protein production with the widely used PGAP, usually considered the methanol-free reference, for the production of the Lipase B from Candida antarctica (CalB). All the three expression systems performance was firstly compared in chemostat cultivations, which enabled to shed light on the influence of µ and CALB expression on the CalB production kinetics. Additionally, the clones harboring the novel expression system were cultivated in fed-batch mode at the optimal conditions observed in chemostat in order to test their potential bioprocess scalability.

Finally, in the last chapter of the thesis, the production of active whole cell biocatalyst based on the human cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) in P. pastoris was afforded. The coexpression of the protein along with its redox partner (cytochrome P450 reductase, CPR) was achieved by means of a bidirectional promoter system. After a screening phase in which up to 8 promoters were tested for CYP2C9/CPR production, the combination that provided the best balance was selected for subsequent bioprocess optimization experiments. In this way, the influence of important bioprocess parameters — pH, µ and methanol addition— on active CYP2C9/CPR whole cell biocatalyst production was determined. Finally, the efficiency of P. pastoris whole cell biocatalyst based on CYP2C9/CPR was tested in a proof of concept reaction of interest, in which ibuprofen is hydroxylated into its oxidized derivatives.