La ausencia de VDR en CMLV previene la calcificación vascular en ERC: Potencial rol del miR-145a

Abstract

La calcificació vascular (CV) es una complicació molt prevalent en la malaltia renal crònica (MRC) i s’associa amb una alta mobilitat i mortalitat en pacients amb MRC. El receptor de la vitamina D (VDR) s’ha considerat que té un rol important en la diferenciació osteoblástica de les cèl·lules de múscul llis vascular (CMLV), tot i que el mecanisme concret encara no està clar. A més a més, la capacitat de VDR per influir en l’expressió de varis microRNAs (miRNAs), així com la gran quantitat de miRNAs presents en les CMLV, ens fa enfocar-nos en aquestes petites molècules com importants reguladores de la diferenciació i modulació fenotípica de les CMLV. L’objectiu d’aquest estudi va ser avaluar l’efecte de la deficiència de VDR en la calcificació vascular en MRC i la possible implicació del miR-145a en aquest procés. Vam confirmar un increment de tinció immunohistoquímica de VDR juntament amb un nivells augmentats de calci en arteries epigàstriques de pacients amb MRC comparat amb arteries de donants sans. Els ratolins amb nefrectomia 5/6 també mostraven alts nivells de calci arterial i de tinció immunohistoquímica de VDR comparat amb els ratolins controls. Els ratolins knockout condicionals per VDR en CMLV (Cre+ VDRlox/lox) sotmesos a una nefrectomia i tractats amb dieta alta en fòsfor i calcitriol van mostrar nivells significativament més baixos de contingut de calci, expressió d’osteopontina i lamin A, així com uns nivells més alts d’expressió de SOST comparat amb ratolins Cre+ VDRwt/wt amb el mateix tractament. A més a més, els ratolins Cre+ VDRwt/wt amb ERC i CV mostraven significativament nivells més baixos d’expressió arterial del miR-145a comparat amb els ratolins amb una eliminació específica de VDR en CMLV. In vitro, les CMLV VDRwt tractades amb medis calcificants mostraven nivells més alts de calci que les CMLV VDRko, juntament amb un increment de OPN a nivell de mRNA i proteïna. Els nivells del miR-145a disminuïen en CMLV amb condicions calcificants, tant en VDRwt com en VDRko, contràriament als resultats in vivo. Mitjançant la transfecció del miR-145a vam detectar un lleuger descens de la calcificació i de l’expressió de OPN en condicions calcificants. Concloem que l’eliminació del VDR de les CMLV protegeix enfront la calcificació vascular en MRC i que els mecanismes que regulen aquesta CV poden involucrar al miR-145a.

La calcificación vascular (CV) es una complicación muy prevalente en la enfermedad renal crónica (ERC) y se asocia con la alta morbilidad y mortalidad en estos pacientes. El receptor de la vitamina D (VDR) se ha considerado que tiene un rol importante en la diferenciación osteoblástica de las células de musculo liso vascular (CMLV), aunque el mecanismo preciso aún no es claro. La capacidad de VDR para influenciar la expresión de varios microRNAs (miRNAs), así como la gran cantidad de miRNAs presentes en CMLV, nos hizo prestar atención a estas pequeñas moléculas como posibles reguladoras del cambio fenotípico de las CMLV. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la deficiencia de VDR en la calcificación vascular en ERC y la posible implicación del miR-145a en este proceso. Confirmamos un incremento de tinción inmunohistoquímica de VDR juntamente con unos niveles más altos de calcio en arterias epigástricas de pacientes con ERC comparado con arterias de donantes sanos. Así como también, ratones con nefrectomía 5/6 mostraban altos niveles de calcio arterial y tinción inmunohistoquímica de VDR comparado con los ratones controles. Los ratones knockout condicionales para VDR en CMLV (Cre+ VDRlox/lox) sujetos a una nefrectomía y tratados con dieta alta en fosforo y calcitriol, mostraron niveles significativamente disminuidos de contenido de calcio, de expresión de osteopontina y lamin A, así como unos niveles más altos de expresión de SOST en arteria comparado con los ratones Cre+ VDRwt/wt con el mismo tratamiento. Además, los ratones Cre+ VDRwt/wt con ERC y CV, mostraron una disminución significativa del miR-145a comparado con los ratones con Cre+ VDRlox/lox. In vitro, las CMLV VDRwt con medios calcificantes mostraron niveles más altos de calcio que las CMLV VDRko, junto con un incremento de OPN. Los niveles del miR-145a disminuían en CMLV con condiciones calcificantes, tanto en VDRwt como en VDRko, contrariamente a los resultados in vivo. Mediante la transfección del miR-145a detectamos un ligero descenso del calcio y la expresión de OPN en condiciones calcificantes. Concluimos que la eliminación de VDR de las CMLV previene la calcificación vascular en ERC y que los mecanismos que regulan esta CV pueden involucrar al miR-145a.

Vascular calcification (VC) is a highly prevalent complication of chronic kidney disease (CKD) and, when present, is associated with the higher morbidity and mortality in CKD patients. Vitamin D receptor (VDR) has been proposed to have an important role in the osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells (VSMCs); nevertheless the precise mechanism is unclear. The potential of VDR to influence widespread microRNAs (miRNAs) expression, as well as a myriad of miRNAs present in VSMCs drew attention to these small molecules as important regulators of VSMCs differentiation and phenotypic modulation. The aim of this study was to evaluate the effect of VDR deficiency on vascular calcification in CKD and the possible involvement of miR-145a in this process. We confirmed an increase of VDR immunostaining together with higher calcium in epigastric arteries from CKD patients compared with arteries from control non-CKD donors. We next analysed arteries from mice subjected to 5/6 nephrectomy. CKD affected mice showed higher levels of calcium content and VDR immunostaining in their arteries compared with control mice. VSMC-VDR conditional knockout mice (Cre+ VDRlox/lox) subjected to a subtotal nephrectomy and treated with high phosphate diet plus calcitriol showed significantly lower levels of vascular calcium content, osteopontin and lamin A expression, as well as markedly higher levels of SOST expression compared with their counterparts (Cre+VDRwt/wt) on the same treatment. Cre+VDRwt/wt mice affected by CKD and presenting VC showed significantly lower levels of expression of arterial miR-145a compared with mice with targeted deletion of VDR in VSMCs. In vitro, VDRwt VSMCs treated with calcification medium demonstrated higher levels of calcification than VDRko VSMCs, alongside an increased OPN. Levels of miR-145a decreased in VSMC with calcification conditions, both in VDRwt, which developed calcification, and in VDRko in which we didn’t detect calcium previously, contrarily to in vivo results. Through miR-145a transfection we detect a slight decrease in calcium and OPN expression in calcification conditions We conclude that VSMC’s VDR elimination prevents vascular calcification in CKD and that the mechanisms regulating VC might involve miR-145a, which warrant further investigations in this direction.