Connection between protein disorder, folding and aggregation: Physiological and Pathological implications

Abstract

Les Proteïnes o Regions Intrínsecament Desordenades (IDPs, IDRs) son una classe de polipèptids que són incapaços d’adoptar una estructura tridimensional definida en el seu estat natiu. La seva funció depèn de la flexibilitat estructural i de la fluctuació entre un conjunt de conformacions diferents. Aquest fet els permet interaccionar amb una gran varietat de macromolècules i regular la transmissió de senyals cel·lulars. Els canvis en els factors ambientals, les modificacions post-traduccionals i la interacció amb altres proteïnes influeixen en el seu estat estructural, induint-ne el plegament condicional i, per tant, modificant-ne la seva funció. En aquesta tesi enfoquem la transició desordre-ordre des de dues perspectives diferenciades. D’una banda, el seu paper en les funcions fisiològiques i, per l’altra, la seva implicació en el desenvolupament de malalties. En primer lloc, estudiem com l’estat redox afecta en la transició estructural de dues proteïnes riques en disulfur que localitzen a l’espai intermembranós del mitocondri. Tot i compartir la mateixa conformació nativa, demostrem que ambdues proteïnes segueixen vies de plegament independents. Tant la seqüència primària d’aminoàcids com l’estat conformacional inicial defineixen la via de plegament. Per una banda, COX17 es troba desordenada en l’estat reduït i el tancament de la regió pròxima al loop estructural dirigeix el plegament. Per l’altra, l’estat reduït de TRIAP1 es comparable a un molten globule. Aquesta conformació empaquetada limita la reacció de plegament, però es indispensable per a que TRIAP1 pugui realitzar la seva funció cel·lular. En segon lloc, estudiem la correlació seqüencial entre regions d’interacció i la tendència a formar agregats amiloides, en el context de les regions desordenades. Demostrem que Hsf1, una proteïna reguladora de la proteostasis, conté un domini críptic d’agregació prion-like en la seva regió desordenada del C-terminal. Efectivament, aquest domini agrega i forma fibres amiloides. Finalment, ens centrem en l’agregació de la proteïna α-synuclein, responsable de la malaltia del Parkinson. El desordre estructural d’aquesta proteïna impedeix l’ús d’estratègies racionals que permetin dissenyar molècules que inhibeixin la seva agregació. En aquest context, implementem un cribratge massiu com a metodologia per identificar noves molècules que puguin ser efectives. Mitjançant aquesta tècnica, hem identificat tres candidats amb activitat inhibidora: Syunclean-D, ZPD-2, and ZPDm. En aquesta tesi, mostrem les seves propietats anti-amiloides i neuroprotectores, al mateix temps que discutim el seu potencial farmacològic.

Las proteínas o Regiones Intrínsecamente Desordenadas (IDPs, IDRs) son una clase de polipéptidos incapaces de adoptar una estructura tridimensional definida en su estado nativo. Su función depende de la flexibilidad estructural y de la fluctuación entre un conjunto de diferentes conformaciones. Esto les permite interaccionar con una gran variedad de macromoléculas y regular la transmisión de señales celulares. Variaciones en los factores ambientales, las modificaciones post-traduccionales y la interacción con otras proteínas influyen en su estado estructural de éstas, lo que induce su plegamiento condicional y modifica su función. En esta tesis enfocamos la transición desorden-orden desde dos perspectivas deferentes. Por un lado, su papel en las funciones fisiológicas y, por el otro, su implicación en el desarrollo de enfermedades. En primer lugar, estudiamos como el estado redox afecta en la transición estructural de dos proteínas ricas en disulfuros, que localizan en el espacio intermembranalde la mitocondria. Aunque comparten a misma conformación nativa, demostramos que las dos proteínas siguen vías de plegamiento independientes. Tanto su secuencia primaria de amino ácidos como su estado conformacional inicial definen su plegamiento. Por un lado, COX17 se encuentra desordenada en su estado reducido y el cierre de la región proximal al loop estructural dirige su plegamiento. Por el otro, el estado reducido de TRIAP1 es comparable a un molten globule. Esta conformación empaquetada limita su reacción de plegamiento, pero es indispensable para que TRIAP1 pueda realizar su función celular. En segundo lugar, estudiamos la correlación secuencial entre regiones de interacción y su tendencia a formar agregados amiloides, en el contexto de las regiones desordenadas. Demostramos que Hsf1, una proteína reguladora de la proteostasis, contiene un dominio críptico de agregación prion-like en la región desordenada del C-terminal. Confirmamos que este dominio agrega y forma fibras amiloides. Finalmente, nos centramos en la agregación de la proteína α-synucleina, responsable de la enfermedad del Parkinson. El desorden estructural de dicha proteína impide el uso de estrategias racionales que permitan diseñar moléculas inhibidoras de su agregación. En este contexto, implementamos un cribaje masivo como metodología para identificar nuevas moléculas. Mediante esta técnica, hemos identificado tres candidatos con esta actividad inhibidora: Syunclean-D, ZPD-2, and ZPDm. En esta tesis, mostramos sus propiedades anti-amiloides y neuroprotectoras, al mismo tiempo que discutimos su potencial farmacológico.

Intrinsically Disordered Proteins (IDPs) and Regions (IDRs) are a class of polypeptides that lack defined three-dimensional structures. Instead, they populate a dynamic ensemble of flexible conformers that endorse them with unique properties to interact with multiple partners and mediate in signal transduction. Environmental factors, post-translational modifications, and binding partners impact the IDPs’ conformational space, promoting structural transitions that regulate their functions.

This thesis has addressed the disorder-to-order transition phenomenon from two perspectives: its physiological function and its implication in disease.

First, we studied the redox-driven conformational transition of two small disulfide-rich mitochondrial proteins. We demonstrate that both polypeptides follow different folding pathways despite sharing a common fold. The reaction is determined by the primary sequence of amino acids and the reduced and unfolded species’ conformational state. Reduced COX17 is mostly disordered, and its folding is directed by the local packing of a loop region. In contrast, TRIAP1 reduced state resembles a molten globule. This early loosely packed conformer biases and slows down the folding pathway, but its population is unavoidable, because it arises from functional constraints in the folded state.

Second, we addressed the sequential overlap between amyloidogenic and interaction regions in the context of disordered proteins, to demonstrate that the extended C-terminus of the proteostasis guardian protein, Hsf1, contains a cryptic prion-like domain with the potential to assemble into amyloid fibrils.

Finally, we focused our attention on the aggregation of α-synuclein, the main culprit of the onset and progression of Parkinson’s Disease. This protein’s disordered nature precludes the use of rational strategies to design effective drugs that block its transition to ordered and deleterious amyloids. Therefore we implemented a blind high-throughput screening methodology to identify novel small molecules that might succeed in that purpose. This effort rendered three promising candidates: Syunclean-D, ZPD-2, and ZPDm. Their anti-amyloidogenic and neuroprotective properties were characterized, and their pharmacologic potential was discussed.”