La inhibició de les proteases calpaïnes com a estratègia farmacològica en el tractament del remodelat ventricular

Abstract

La insuficiència cardíaca (IC) crònica representa una de les principals causes de morbiditat i mortalitat mundial. Els canvis estructurals i funcionals que caracteritzen el remodelat cardíac que es produeix en resposta a qualsevol estímul patològic crònic s’associen causalment amb el desenvolupament de la IC. Els actuals tractaments de la IC tenen una eficàcia insuficient, fet que fa necessari trobar noves dianes i estratègies que limitin la progressió del remodelat ventricular i aparició de IC. Les calpaïnes, proteases dependents de calci, es sobreactiven durant la isquèmia-reperfusió cardíaca, i contribueixen a la mort dels cardiomiòcits associada a la reperfusió del miocardi i a la mida de l’infart. Diverses evidencies senyalen que les calpaines podrien tenir també un paper en el remodelat postinfart i en cardiomiopaties no isquèmiques, però un nombre molt limitat d’estudis pre-clínics ha examinat els efectes de la seva inhibició farmacològica en el remodelat ventricular. L’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat caracteritzar la contribució de les calpaïnes als processos de remodelat cardíac tant d’origen isquèmic com no isquèmic, definir els mecanismes responsables i avaluar l’eficàcia de la inhibició farmacològica de les calpaïnes com a nou tractament contra el remodelat ventricular i IC. La primera part de la tesi avalua els efectes de la inhibició farmacològica de les calpaïnes per via oral sobre el remodelat postinfart desenvolupat en un model d’oclusió transitòria de l’artèria descendent anterior. Els resultats obtinguts demostren que el remodelat postinfart correlaciona amb un increment en l’expressió i activitat de les calpaïnes i una disminució dels nivells de la calpastatina. L’administració aguda i crònica del inhibidor va atenuar l’activació de les calpaïnes, va reduir l’expansió de la cicatriu i la dilatació i disfunció ventricular. El tractament agut va reduir la mida de l’infart i la resposta inflamatòria associada. El tractament crònic però no l’agut va atenuar la hipertròfia dels cardiomiòcits i la infiltració de col•lagen en el miocardi no infartat. Aquests resultats van correlacionar-se amb una reducció de la degradació de IκB i una menor activació de NF-κB. La segona part de la tesi estudia la contribució de les calpaïnes al remodelat induït per estímuls crònics no isquèmics, fent servir dos models que reprodueixen l’estimulació neurohumoral que s’observa en pacients amb IC com són l’estimulació adrenèrgica i l’estimulació del sistema renina-angiotensina, així com un model de sobrecàrrega de pressió per constricció aòrtica transversal (TAC) en ratolins. L’estrés cardíac induït amb isoproterenol va augmentar l’expressió i activitat de les calpaïnes, i aquest increment va associar-se amb hipertròfia ventricular i fibrosi intersticial. La coadministració crònica i per via oral del inhibidor de les calpaïnes va atenuar el desenvolupament de remodelat ventricular que caracteritza tots aquests models. A més, els resultats obtinguts fent servir ratolins amb deleció gènica de GRK2 demostren que la contribució de les calpaïnes a la hipertròfia induïda per isoproterenol està associada a un increment dels nivells de GRK2, causat per la degradació de MDM2 i IκB. En conclusió, els resultats presentats en aquesta tesi demostren que la sobreexpressió i sobreactivació de les calpaïnes en el miocardi és una resposta comuna a diferents estímuls patològics crònics, i té un efecte causal en la resposta hipertròfica i fibròtica que caracteritza el remodelat ventricular. Es proposa que l’activació depenent de calpaïna de NF-κB jugaria un paper clau tant en el remodelat postinfart com el produït per estimulació neurohumoral. A més, es demostra que la hipertròfia induïda per isoproterenol és conseqüència d’un increment en els nivells de GRK2 per mecanismes dependents de les calpaïnes. Els resultats obtinguts demostren que la inhibició farmacològica de les calpaïnes de forma crònica per via oral és possible i que atenua el procés de remodelat.

La insuficiencia cardíaca (IC) crónica representa una de las principales causas de morbilidad y mortalidad mundial. Los cambios estructurales y funcionales que caracterizan el remodelado cardíaco que se produce en respuesta a cualquier estímulo patológico crónico se asocian causalmente con el desarrollo de la IC. Los tratamientos actuales de la IC tienen una eficacia insuficiente, siendo necesario encontrar nuevas dianas y estrategias que limiten la progresión del remodelado ventricular y aparición de IC. Las calpaínas, proteasas dependientes de calcio, se sobreactivan durante la isquemia-reperfusión cardíaca, y contribuyen a la muerte de los cardiomiocitos asociada a la reperfusión del miocardio y al tamaño del infarto. Distintas evidencias señalan que las calpaínas podrían tener también un papel en el remodelado postinfarto y en cardiomiopatías no isquémicas, pero solo un número muy limitado de estudios pre-clínicos ha examinado los efectos de su inhibición farmacológica en el remodelado ventricular. El objetivo principal de esta tesis ha sido caracterizar la contribución de las calpaínas a los procesos de remodelado cardíaco tanto de origen isquémico como no isquémico, definir los mecanismos responsables y evaluar la eficacia de su inhibición farmacológica como nuevo tratamiento contra el remodelado ventricular e IC. La primera parte de la tesis evalúa los efectos de la inhibición farmacológica de las calpaínas por vía oral sobre el remodelado postinfarto desarrollado en un modelo de oclusión transitoria de la arteria descendente anterior. Los resultados obtenidos demuestran que el remodelado postinfarto correlaciona con un incremento en la expresión y actividad de las calpaínas y una disminución de calpastatina. La administración aguda y crónica del inhibidor atenuó la activación de las calpaínas, redujo la expansión de la cicatriz y la dilatación y disfunción ventricular. El tratamiento agudo redujo el tamaño del infarto y la respuesta inflamatoria asociada. El tratamiento crónico pero no el agudo atenuó la hipertrofia de los cardiomiocitos y la infiltración de colágeno en el miocardio no infartado. Estos resultados se correlacionaron con una reducción en la degradación de IκB y una menor activación de NF-κB. La segunda parte de la tesis estudia la contribución de las calpaínas en el remodelado inducido por estímulos crónicos no isquémicos, usando dos modelos que reproducen la estimulación neurohumoral que se observa en pacientes con IC como son la estimulación adrenérgica y la del sistema renina-angiotensina, así como un modelo de sobrecarga de presión por constricción aórtica transversal (TAC) en ratones. El estrés cardíaco inducido con isoproterenol aumentó la expresión y actividad de las calpaínas, y este incremento se asoció con hipertrofia ventricular y fibrosis intersticial. La coadministració crónica y por vía oral del inhibidor de las calpaínas atenuó el desarrollo de remodelado ventricular que caracteriza todos estos modelos. Además, los resultados obtenidos usando ratones con deleción génica de GRK2 demuestran que la contribución de las calpaínas a la hipertrofia inducida por isoproterenol está asociada a un incremento de los niveles de GRK2, causado por la degradación de MDM2 y IκB. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis demuestran que la sobreexpresión y sobreactivación de las calpaínas en el miocardio es una respuesta común a diferentes estímulos patológicos crónicos, y tiene un efecto causal en la respuesta hipertrófica y fibrótica que caracteriza el remodelado ventricular. Se propone que la activación dependiente de calpaïna de NF-κB jugaría un papel clave tanto en el remodelado postinfarto como el producido por estimulación neurohumoral. Además, se demuestra que la hipertrofia inducida por isoproterenol es consecuencia del incremento de GRK2 por mecanismos dependientes de las calpaínas. Los resultados obtenidos demuestran que la inhibición farmacológica de las calpaínas de forma crónica por vía oral es posible y que atenúa el proceso de remodelado.

Heart failure (HF) is a chronic heart disease and represents one of the main causes of morbidity and mortality worldwide. The structural and functional changes that characterize cardiac remodelling that occurs in response to any chronic pathological stimulus are causally associated with the development of HF. Current pharmacological treatments have limited efficacy and reveal an urgent need for novel targets and strategies aimed to prevent the progression of ventricular remodelling and the onset of HF. Calpains, a family of calcium dependent cystein proteases, are overactivated during myocardial ischemia-reperfusion and contribute to cardiomyocyte death associated with myocardial reperfusion and hence, to infarct size. Different evidences show that calpains could also have a role in post-infarction remodelling and non-ischemic cardiomyopathies, but only few pre-clinical studies have explored the effects of calpain inhibition in the ventricular remodelling. The main objective of the present thesis has been to characterize the calpain contribution to cardiac remodelling of both ischemic and non-ischemic origin, define the mechanisms involved and to evaluate the efficacy of calpain pharmacological inhibition as a new treatment against ventricular remodelling and HF. The first part of this thesis analyses the effect of calpain pharmacological inhibition carried out with oral administration of an inhibitor against ventricular post-infarction remodelling in a model of anterior descending artery transient occlusion. The results show that post-infarct remodelling correlates with an increase in the protein expression and activity of calpains and a decrease in the levels of calpastatin. Acute and chronic administration of the inhibitor attenuated calpain activation, reduced scar expansion and ventricular dysfunction and dilation. Acute treatment reduced infarct size and associated inflammation. Chronic but not acute treatment attenuated cardiomyocyte hypertrophy and collagen infiltration in the non-infarcted myocardium. These results correlated with a reduction in the IκB degradation and a lower NF-κB activation. The second part of this thesis studies the calpain contribution to myocardial remodelling induced by chronic non-ischemic stimuli, using two models that reproduce the neurohumoral stimulation observed in patients with HF such as adrenergic stimulation and stimulation of the renin-angiotensin system, as well as a model of pressure overload inducted by transverse aortic constriction (TAC). Isoproterenol-induced cardiac stress produced an increased expression and activity of calpains, and this increase was associated with ventricular hypertrophy and interstitial fibrosis. Chronic oral coadministration of calpain inhibitor attenuated the ventricular remodelling that characterizes all these experimental models. Results obtained using mice with genetic downregulation of GRK2 expression prove that calpain contribution to isoproterenol induced hypertrophy is associated with an increased GRK2 levels. Calpain-dependent GRK2 regulation is consequence of the proteolysis of its ubiquitin ligase MDM2 and IκB degradation and subsequent NF-κB activation. In conclusion, the results presented in this thesis demonstrate that myocardial overexpression and overactivation of calpains is a common response to different chronic pathological stimuli, and has a causal role in the hypertrophic and fibrotic response that characterizes ventricular remodelling. It is proposed that the calpain depedent-activation of the nuclear factor NF-κB plays a key role in both post-infarction remodelling and remodelling produced by neurohumoral stimulation. Moreover, it’s proved that isoproterenol induced hypertrophy results from increased GRK2 levels through calpain-dependent mechanisms. The results obtained show that oral and chronic pharmacological inhibition of calpains is feasible and that that inhibition attenuates the remodelling process.