Estudios de la interacción de los receptores de dopamina con otros receptores implicados en la enfermedad de Huntington

Abstract

En la enfermedad de Huntington (HD), muchos síntomas están asociados con alteraciones en las funciones reguladas por la dopamina y el glutamato; una intervención directa sobre los receptores de dopamina D1 (D1R) pueden provocar numerosos efectos secundarios dada la amplia distribución en el sistema nervioso central. En nuestro grupo de investigación se demostró que el heterómero que forman los D1R con los receptores H3 de histamina (D1R- H3R), y que posee nuevas propiedades bioquímicas y farmacológicas, podría actuar como una posible diana terapéutica para regular la sobreactivación del D1R mediante una modulación por parte del H3R en etapas tempranas de HD. En células Wt y modelo de HD demostramos ahora, mediante ensayos de ligación por proximidad (PLA), la presencia de los heterómeros A1R-D1R, A2AR-D2R, D1R-D3R D1R-NMDAR y H3R-NMDAR que podrían considerarse nuevas dianas para HD. D1R-NMDAR y H3R-NMDAR señalizan a través de la vía de fosforilación de ERKs; sin embargo, en el modelo HD no se modificó dicha señalización. En la vía del AMPc, H3R-NMDAR presentó un cross-talk positivo de NMDAR sobre H3R para las células Wt y negativo para las células HD. Mediante ensayos de unión de radioligandos, los ligandos del H3R: imetit y RAMH (agonistas), A331440, carcinina, conessina y VUF 4904 (antagonistas) modulan alostéricamente la unión de la dopamina al D1R, específicamente al segundo protómero del homómero D1R-D1R. Además, mediante estudios de BRET, se confirmó que estos receptores forman un complejo heterotetrámero D1R-D1R-H3R-H3R que puede activar diferencialmente los distintos subtipos Gαs y Gαi, éste último a altas concentraciones de agonistas de D1R. Concretamente, entre los subtipos de proteína Gαi, el heterómero D1R-H3R tiene preferencia por los subtipos Gαi1 y Gαo2. Al determinar la afinidad de ligandos de H3R al unirse a su receptor en presencia o no de D1R, se determinó que los antagonistas A331440, ROS, conessina y JNJ10181457 mostraron mejor afinidad por el heterómero D1R-H3R que sobre el homómero H3R-H3R, lo que indica la existencia de una modulación alostérica de D1R sobre el centro ortostérico de H3R que favorece la unión de estos ligandos a H3R dentro del heterómero. El JNJ10181457, presentó una mejor afinidad de unión al heterómero y también una mayor potencia de bloqueo de la señal del AMPc inducida por la activación del H3R en el heterómero. Esto significa que el D1R ejerce de modulador alostérico positivo tanto de la unión como del efecto antagónico de la vía del AMPc del JNJ10181457. Estos resultados hacen de este antagonista un candidato ideal como lead compound en la búsqueda de ligandos de H3R selectivos del heterómero D1R-H3R. Mediante ensayos de BRET de proteína G, CODA-RET y de determinación de AMPc, se ha determinado que los complejos H3R-H3R y D1R-H3R pueden activar a la proteína Gαi al ser tratados con agonistas selectivos de H3R. Al evaluar la preferencia diferencial de estos complejos por las subunidades de Gαi/Gαo, se detectó que ambos complejos pueden activar a las subunidades Gαo1, Gαo2, Gαi1, Gαi2 y Gαi3; sin embargo, podemos decir que RAMH para la subunidad Gαo1, proxyfam para la Gαi1, SAMH para Gαi2 e imetit para Gαi1 y Gαi3 tienen preferencia por el heterómero. Al analizar la vía de activación de las ERKs, cuando el H3R del heterómero D1R-H3R se activó con immepip, se alcanzó un nivel de señalización similar al del SKF 81297. Se encontraron resultados opuestos al analizar la vía de las ERKs y la del AMPc con los ligandos RAMH, immethridina, histamina y SAMH que podrían sugerir un biased agonism que deberá confirmarse con curvas completas de activación de ERKs que permitan calcular las respectivas EC50. Todo ello valida nuestro interés por encontrar ligandos selectivos del heterómero D1R-H3R.

Huntington's disease (HD) presents alterations in dopamine neurotransmission; a direct intervention on dopamine D1 receptors (D1R) would cause numerous side effects. The heteromer with the histamine H3 receptor (D1R-H3R), which has new pharmacological properties, could regulate the overactivation of D1R through modulation by H3R in early stages of HD. In Wt and HD model cells, we demonstrated the presence of the heteromers A1R-D1R, A2AR-D2R, D1R-D3R, D1R-NMDAR and H3R- NMDAR. With cAMP signaling, H3R-NMDAR presented a positive cross-talk of NMDAR over H3R for Wt cells and negative for HD cells. Through binding assays, imetit, RAMH, A331440, carcinin, conessin and VUF 4904 allosterically modulate the binding of dopamine to the second protomer of the D1R-D1R homomer, which is part of the D1R- D1R-H3R-H3R heterotetramer and that can differentially activate the Gαs and Gαi subtypes, the latter at high concentrations of D1R agonists. The D1R-H3R heteromer has a preference for the Gαi1 and Gαo2 subtypes. The antagonists A331440, ROS, conessin and JNJ10181457 showed a greater affinity for the D1R-H3R heteromer than for the H3R-H3R homomer, which indicates an allosteric modulation of D1R on the orthosteric center of H3R favoring the binding of these ligands to H3R. JNJ10181457 also presented a higher blocking power of the cAMP signal induced by the activation of the H3R in the heteromer. This means that D1R acts as a positive allosteric modulator of both the binding and the antagonistic effect of the JNJ10181457 on cAMP pathway. It would be a lead compound in the search for selective H3R ligands of the D1R-H3R heteromer. The H3R-H3R and D1R-H3R complexes can activate all the Gαi protein subtypes when treated with selective H3R agonists; RAMH for Gαo1, proxyfam for Gαi1, SAMH for Gαi2 and imetit for Gαi1 and Gαi3 have a preference for the heteromer. When analyzing the activation pathway of ERKs, immepip activated the H3R of the D1R-H3R heteromer with a level of signaling similar to that of SKF 81297. Opposite results were found when analyzing the pathway of ERKs and that of cAMP with the ligands RAMH, immethridine, histamine and SAMH that could suggest a biased agonism that must be confirmed.